本文關(guān)鍵詞：成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

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【摘要】：糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病，而傳統(tǒng)的藥物和胰島素治療方法卻不能根治該病。近年來，隨著移植技術(shù)的發(fā)展和免疫抑制劑的改進(jìn)，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效，但是由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術(shù)的應(yīng)用受到了制約。胰腺干細(xì)胞是存在于胰腺組織中的成體干細(xì)胞，能夠自我更新并具有多向分化潛能。出生后，胰腺導(dǎo)管組織仍然存在干細(xì)胞，稱為成體胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞。體外分離增殖胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化形成功能性胰島移植治療糖尿病，是有效解決供體短缺的途徑之一，具有重要的意義。但是，國內(nèi)至今尚無成年哺乳動物胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞建系的研究。本研究以SD成年大鼠為試驗材料，建立了1例類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系，并對其分離培養(yǎng)體系、生長特性、表達(dá)特性及裸鼠荷瘤等進(jìn)行了探討。成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系的建立和生物學(xué)特性的研究，對于進(jìn)一步研究成年哺乳動物胰腺組織再生和利用細(xì)胞移植治療糖尿病具有重要的學(xué)術(shù)意義和潛在的應(yīng)用價值。 本研究的主要內(nèi)容包括： 1．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系的建立 以成年大鼠胰腺組織為試驗材料，0.1g/mL Ⅳ型膠原酶消化胰腺組織獲得單個胰腺細(xì)胞，Dextron葡聚糖不連續(xù)密度梯度離心分離得到胰腺導(dǎo)管細(xì)胞。RPMI-1640+10%FBS+0.11g/L丙酮酸鈉+2.383g/L Hepes基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，原代上皮樣胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞和少量成纖維細(xì)胞貼壁生長。0.25%胰蛋白酶+0.04g/L EDTA·2Na消化傳代，逐漸剔除成纖維樣細(xì)胞及其它細(xì)胞，獲得純化的上皮樣胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞。克隆環(huán)挑選單個細(xì)胞增殖而來的細(xì)胞簇，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10ng/mL EGF擴增培養(yǎng)，傳代，建立1例成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系。該細(xì)胞系已傳至33代。倒置顯微鏡下觀察類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞貼壁生長，呈多角形上皮樣；當(dāng)生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣。傳代培養(yǎng)1~2d，，細(xì)胞生長緩慢，3~4d，細(xì)胞開始倍增。從干細(xì)胞生長曲線和傳代情況看，該成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞具有無限增殖潛能。 以80%RPMI-1640+10%FBS+10%DMSO為細(xì)胞保存液，采用4℃，30min→－80℃，12h→－196℃程序性降溫，液氮中已冷凍保存成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞86管，1×109個細(xì)胞；37℃水浴迅速解凍，成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞解凍成活率≥90.8%。 隨機取傳至31代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞擴增至單層，加入終濃度為0.1μg/mL的秋水仙素處理細(xì)胞5h，0.4%氯化鉀低滲30min，固定，滴片，染色，制備染色體標(biāo)本。結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞染色體是正常的二倍體（2n=42）。 2．不同生長因子對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響 以RPMI-1640+10%NBS為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別添加濃度為5、10、15ng/mL的生長因子EGF、bFGF、IGF-Ⅱ或KGF，擴增成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞。采用CCK-8法測定第1~7d的細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加這些生長因子均能促進(jìn)成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖，其中，添加15ng/mL EGF或10、15ng/mL bFGF或10、15ng/mL KGF，能夠顯著促進(jìn)成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖。 3．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的表達(dá)特征 隨機取傳至22代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞，采用免疫熒光化學(xué)反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測其蛋白表達(dá)特性。免疫熒光化學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞表達(dá)CK19，不表達(dá)胰島干細(xì)胞標(biāo)記物（Nestin、Ngn3、Ptf1a、NeuroD2、Pdx-1）、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物（Sox-2）、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物（Ghrelin）及胰腺終末分化細(xì)胞標(biāo)記物（Somatostatin、Secretin、Insulin、Glucagon、AKP）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞表達(dá)Pax4、Pax6、Oct-4、Nanog和PCNA，不表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物CD15/SSEA-1、胰島干細(xì)胞標(biāo)記物MafA和造血干細(xì)胞標(biāo)記物（CD34、CD117/c-kit及CD45）。 4．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞裸鼠荷瘤試驗 隨機取傳至16代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，以1×107個細(xì)胞/0.2mL/site的量接種在裸鼠背部皮下，SPF環(huán)境中正常飼養(yǎng)30d，觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動力。結(jié)果成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)未長出瘤狀物。
【關(guān)鍵詞】：胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞 分離 培養(yǎng) 蛋白表達(dá) 成年大鼠
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R587.1;R-332
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 1 胰腺干細(xì)胞的概念和存在部位13-18
• 1.1 哺乳動物胰腺的發(fā)育和組織結(jié)構(gòu)13-17
• 1.1.1 哺乳動物胰腺組織結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.2 哺乳動物胰腺的發(fā)育14-15
• 1.1.3 胰腺發(fā)育的主要轉(zhuǎn)錄因子15-17
• 1.2 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的概念和存在依據(jù)17-18
• 1.2.1 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的概念17
• 1.2.2 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的存在依據(jù)17-18
• 2 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分離培養(yǎng)18-21
• 2.1 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分離與擴增18-19
• 2.1.1 組織塊培養(yǎng)法18
• 2.1.2 酶消化法18
• 2.1.3 磁激活細(xì)胞分離法18-19
• 2.2 影響胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞分離培養(yǎng)的因素19-21
• 2.2.1 消化液19
• 2.2.2 培養(yǎng)基19
• 2.2.3 生長因子19-21
• 3 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的形態(tài)、增殖及表達(dá)特性21-23
• 3.1 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的形態(tài)特征21
• 3.2 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的增殖21
• 3.3 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的表達(dá)特性21-23
• 3.3.1 Pdx-121-22
• 3.3.2 CK-1922
• 3.3.3 Prominin-122
• 3.3.4 SSEA-422
• 3.3.5 Hnf22-23
• 4 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分化特性23-25
• 4.1 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的多向分化潛能23
• 4.2 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞定向分化形成功能性胰島23-24
• 4.2.1 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化形成胰島23
• 4.2.2 影響胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞分化形成胰島的因子23-24
• 4.3 胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的致瘤性24-25
• 5 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)25-34
• 5.1 材料與方法25-29
• 5.1.1 材料25-26
• 5.1.2 方法26-29
• 5.2 結(jié)果與分析29-31
• 5.2.1 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的分離和擴增29-30
• 5.2.2 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的生長曲線30
• 5.2.3 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的冷存與復(fù)蘇30
• 5.2.4 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的核型30-31
• 5.3 討論31-32
• 5.3.1 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立31-32
• 5.3.2 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的生長行為32
• 5.3.3 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的冷存與復(fù)蘇32
• 5.4 小結(jié)32-34
• 6 影響成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子34-41
• 6.1 材料與方法34-35
• 6.1.1 材料34
• 6.1.2 方法34-35
• 6.2 結(jié)果與分析35-39
• 6.2.1 不同濃度 EGF 對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響35-36
• 6.2.2 不同濃度 bFGF 對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響36-37
• 6.2.3 不同濃度 IGF Ⅱ?qū)Τ赡甏笫箢愐认賹?dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響37-38
• 6.2.4 不同濃度 KGF 對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞吸光度值的影響38-39
• 6.3 討論39-40
• 6.3.1 EGF 對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響39
• 6.3.2 bFGF 對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響39-40
• 6.3.3 IGF Ⅱ?qū)Τ赡甏笫箢愐认賹?dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響40
• 6.3.4 KGF 對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖的影響40
• 6.4 小結(jié)40-41
• 7 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的表達(dá)特性41-48
• 7.1 材料與方法41-44
• 7.1.1 材料41-42
• 7.1.2 方法42-44
• 7.2 結(jié)果與分析44-45
• 7.2.1 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞蛋白水平表達(dá)特征（熒光免疫化學(xué)反應(yīng)）44
• 7.2.2 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞蛋白水平表達(dá)特征（流式細(xì)胞術(shù)）44-45
• 7.3 討論45-47
• 7.3.1 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的表達(dá)特征45-47
• 7.4 小結(jié)47-48
• 8 成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的荷瘤試驗48-50
• 8.1 材料與方法48
• 8.1.1 材料48
• 8.1.2 方法48
• 8.2 結(jié)果與分析48
• 8.3 討論48-49
• 8.4 小結(jié)49-50
• 9 結(jié)論50-51
• 進(jìn)一步研究設(shè)想51-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 附錄59-66
• 致謝66-67
• 作者簡介67-68
• 導(dǎo)師簡介68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：808690