本文關(guān)鍵詞：泛素特異性蛋白酶USP26突變型去泛素化酶活性檢測(cè)

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【摘要】：目的：泛素特異性蛋白酶（ubiquitin specific protease, usp）26基因位于X染色體q26.2區(qū)域，基因編碼區(qū)由一個(gè)外顯子構(gòu)成，含2794個(gè)堿基，編碼913個(gè)氨基酸，推測(cè)其蛋白質(zhì)分子量約104KDa。Usp26基因?qū)儆谌シ核鼗讣易澹╠eubiquitinating enzymes，DUBs），去泛素化酶在泛素蛋白酶體途徑發(fā)揮多個(gè)作用，包括多聚泛素鏈的分離，將被泛素化的蛋白上的泛素去除以避免蛋白被降解，以及去除泛素殘基促進(jìn)蛋白酶體的降解作用和泛素的再利用，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白的活性或其降解。Usp26由wang等首次報(bào)道，分離自小鼠精原細(xì)胞。在人和小鼠中，usp26在睪丸組織特異性表達(dá)。但是目前對(duì)于usp26基因的生理機(jī)制和分子途徑并不十分清楚。最近有一些研究指出，usp26基因多態(tài)性可能與男性不育相關(guān)。Dirac AM等的研究提示USP26在雄激素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用可能與其去泛素化酶活性有關(guān)。因此，我們通過檢測(cè)usp26幾種突變型的去泛素酶活性變化，研究usp26基因的幾種突變型對(duì)其去泛素化活性的影響，為usp26的分子途徑和生理功能提供線索，同時(shí)為研究usp26基因與男性不育癥的關(guān)聯(lián)性研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1質(zhì)粒的構(gòu)建。野生型usp26基因由荷蘭研究者Annette M.G. Dirac提供。利用野生型usp26基因?yàn)槟０�，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入BamHI酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)構(gòu)建質(zhì)粒。引物序列：上游引物為5’-GGATCCATGGCTGCCCTATTCCTAC-3’，下游引物為5’-GGATCCTTATTCCTTCTGAAGGGTCTCC-3’。PCR產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行BamHI位點(diǎn)酶切反應(yīng)，連接到pGEX-6p-1中。構(gòu)建的質(zhì)粒pGEX-usp26最后進(jìn)行測(cè)序鑒定。將pET-3d質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子以BglII和HindIII酶切位點(diǎn)切下，與BamHI及HindIII處理的pACYC184質(zhì)粒進(jìn)行連接，確保T7啟動(dòng)子處于閱讀編碼框內(nèi)。將已構(gòu)建的pGEX-usp26中的usp26基因以BamHI酶切位點(diǎn)切下，連入pAC-T7中。將構(gòu)建的pAC-T7-usp26質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。 2定點(diǎn)突變。利用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建5個(gè)SNP：468GT、1274CT、2144AT、2204TG、2239AT突變型及CS無活性突變型911GC。分別以特異性引物進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性30sec，95℃變性30sec，55℃復(fù)性1min，68℃延伸10min，18次循環(huán)，最后72℃延伸5min。 3去泛素化酶活性分析。采用模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析。質(zhì)粒pACYC-usp46和pAC-T7分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。將pAC-T7-usp26野生型、pAC-T7-usp26突變型、pACYC-usp46及pAC-T7分別與pGEX-Ub52共轉(zhuǎn)化入BL21細(xì)菌中，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。細(xì)菌超市破碎后，將底物GST融合蛋白用GSH-Sepharose Resin純化后，10%SDS PAGE電泳檢測(cè)。另一模型底物Ub-Met-β-gal檢測(cè)體系，采用pGEX-usp46和pGEX-6p-1分別作為陽性和陰性對(duì)照。pGEX-usp26野生型、pGEX-usp26突變型、pGEX-usp46及pGEX-6p-1分別與與pAC-M-β-gal共表達(dá)與BL21細(xì)菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，采用小鼠β-gal抗體及兔抗小鼠熒光抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果收集。 結(jié)果： 1定點(diǎn)突變：對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析證實(shí)定點(diǎn)突變成功突變位點(diǎn)468GT,1274CT,2144AT,2204TG,2239AT及911GC。 2USP26具有去泛素化酶活性：為檢測(cè)USP26去泛素化酶活性，將其分別與模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal共表達(dá)與BL21細(xì)菌中。USP46與GST-Ub52共表達(dá)后，GST-Ub52被去泛素化，，產(chǎn)生分子量約36KDa的產(chǎn)物。野生型USP26與USP46一樣具有去泛素化酶活性，其活性較之USP46更為顯著。與預(yù)期一致，USP26CS突變型失去去泛素化酶活性。用模型底物Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與GST-Ub52模型底物的分析一致。 3USP26的5個(gè)SNP活性檢測(cè)：為檢測(cè)USP26468GT，1274CT，2144AT，2204TG及2239AT突變?nèi)シ核鼗傅幕钚�，將各個(gè)突變質(zhì)粒分別與模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal共表達(dá)于BL21細(xì)菌中。與GST-Ub52共表達(dá)后，468GT，1274CT，2144AT，2204TG及2239AT突變株，與野生型一樣，GST-Ub52被去泛素化，產(chǎn)生分子量約36KDa的產(chǎn)物。用模型底物Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析的結(jié)果與GST-Ub52模型底物的分析一致，總之，此5種突變型未影響USP26的去泛素化酶活性。 結(jié)論： 1通過定點(diǎn)突變PCR，成功突變usp26基因5種SNP突變位點(diǎn)。 2GST-Ub52及Ub-Met-β-gal模型底物檢測(cè)去泛素化酶活性體系可有效檢測(cè)USP26的去泛素化活性。 3野生型USP26具有顯著的去泛素化酶活性。當(dāng)USP26活性關(guān)鍵位點(diǎn)第304位半胱氨酸被絲氨酸取代后，USP26失去去泛素化酶活性。 4Usp26基因的五個(gè)SNP：468GT、1274CT、2144AT、2204TG、2239AT，并未影響USP26的去泛素化酶活性。
【關(guān)鍵詞】：泛素特異性蛋白酶 USP26 單核苷酸多態(tài)性 基因表達(dá) 去泛素化酶活性
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11
• 材料與方法11-19
• 結(jié)果19-22
• 附圖22-27
• 討論27-28
• 結(jié)論28
• 參考文獻(xiàn)28-32
• 綜述 泛素特異性蛋白酶 USP26 的研究進(jìn)展32-41
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 致謝41-42
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷42

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張潔;邵小光;史艷彬;鄢磊;王磊;田宏;邱曙東;;泛素特異蛋白酶26基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥的相關(guān)性研究[J];中華男科學(xué)雜志;2012年02期

本文編號(hào)：804343