發(fā)布時間：2017-09-05 03:09

  本文關鍵詞：小鼠胸腺及其對異種抗原細胞的應答

  更多相關文章： 胸腺內(nèi)注射 異種抗原 胸腺微環(huán)境 免疫耐受 MHC限制

【摘要】：研究背景與目的 胸腺是哺乳動物的中樞免疫器官,是T細胞分化發(fā)育和成熟的場所,胸腺為T細胞發(fā)育提供了一個縝密而復雜的微環(huán)境,有序的調(diào)控T細胞的發(fā)育成熟和遷移。胸腺基質(zhì)細胞、可溶性分子以及細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成T細胞發(fā)育的胸腺微環(huán)境。胸腺基質(zhì)細胞間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不僅起網(wǎng)狀支架作用,而且由于這些細胞表面攜帶大量表面分子、并可以分泌多種胸腺激素和細胞因子,從而為胸腺細胞的發(fā)育和成熟提供合適的微環(huán)境。T細胞在胸腺內(nèi)經(jīng)歷TCR重排,陽性選擇和陰性選擇等發(fā)育過程最終發(fā)育為成熟的T淋巴細胞并遷移到外周免疫器官。 根據(jù)傳統(tǒng)的誘導性中樞耐受的理論機制,如果T細胞發(fā)育過程中在胸腺內(nèi)接觸到異基因的抗原,則會被誘導出對該異基因外周移植物的耐受,同時,血-胸腺屏障使血液中的大分子物質(zhì)包括外來抗原不能進入胸腺,所以胸腺內(nèi)注射異基因抗原可以躲過免疫監(jiān)視,誘導出對異基因抗原耐受的T細胞。為了探索異種抗原細胞在機體內(nèi)的生物學特性及機體產(chǎn)生的免疫耐受和免疫排斥情況,我們將作為異種不同組織的、MHC差異較大的抗原人肝癌細胞Hep-G2注射到10-15d的C57BL/6小鼠的胸腺中,動態(tài)觀察小鼠胸腺對其發(fā)生的應答,進而了解抗原在小鼠胸腺微環(huán)境中對T細胞發(fā)育的影響及胸腺內(nèi)可能發(fā)生的免疫應答機制和外源人肝癌細胞對胸腺微環(huán)境及T細胞發(fā)育分化的影響,以及異種人肝癌細胞在小鼠胸腺內(nèi)的命運。 研究方法 1.小鼠胸腺內(nèi)注射及注射對小鼠胸腺造成的組織病理變化分析 1)小鼠胸腺發(fā)育情況分析； 2)細胞培養(yǎng)與DiI標記； 3)胸腺內(nèi)注射方法的簡化； 4)注射效率的評估：解剖學觀察判斷及FCM分析檢測注射效率 5)注射后小鼠體重變化分析與注射方法對小鼠的損傷評估； 6)石蠟切片制作與HE染色觀察； 2.小鼠胸腺對異種抗原細胞的應答 1)人肝癌細胞培養(yǎng)與DiI標記； 2)小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞； 3)小鼠胸腺組織稱重及胸腺細胞絕對值計數(shù)； 4)石蠟切片制作與HE染色觀察胸腺組織病理變化； 5)FCM分析胸腺內(nèi)各類細胞亞群比例的變化(T細胞、NK/NKT細胞及調(diào)節(jié)性細胞)； 6)FCM分析胸腺細胞凋亡情況； 研究結(jié)果 第一部分： 小鼠胸腺發(fā)育情況分析 小鼠在青春期前快速生長和發(fā)育,到青春期時達到一個頂峰,在此之后便開始萎縮；小鼠胸腺的體積也隨年齡增長而變化。 Dil染色標記觀察 Hep-G2人肝癌細胞在含有20ug/ml DiI的基本培養(yǎng)基中標記30min后,細胞標記成功,并發(fā)射出強烈的紅色熒光。 注射效率評估 通過解剖學觀察,成鼠組的注射成功率為81.47%,乳鼠組的注射成功率為76%,FCM分析的結(jié)果證實此種注射方法基本能夠保證注射的準確性。 注射方法對小鼠損傷程度的評估 通過對注射后小鼠行為及體重的變化分析,我們發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組小鼠在體重和行為上均未表現(xiàn)出明顯變化,由此我們認為此注射方法對小鼠的損傷程度很小,值得應用和推廣。 石蠟切片HE染色觀察結(jié)果 Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)遭遇到淋巴細胞的攻擊與殺傷,注射后3d就檢測到淋巴細胞的浸潤及巨噬細胞的募集；注射后7d,大部分的腫瘤細胞已經(jīng)死亡,腫瘤細胞周圍密集大量的淋巴細胞；注射后14d,已經(jīng)檢測不到存活的腫瘤細胞,腫瘤細胞形態(tài)模糊,周圍大量淋巴細胞密集；注射后21d和28d,已經(jīng)檢測不到腫瘤細胞的存在。 第二部分： 胸腺重量及胸腺細胞總數(shù)變化 相比于平行對照組,胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞后7d,14d及21d實驗組小鼠的胸腺重量明顯增加,而此時的胸腺細胞總數(shù)卻明顯減少。 小鼠胸腺組織有一定損傷 注射后3d檢測到注入人肝癌細胞的胸腺組織區(qū)域有機械損傷的跡象,有的能明顯看出是注射針在胸腺內(nèi)入針時造成的機械損傷,有些則為細胞懸液及注射針推力共同作用的結(jié)果。 小鼠胸腺組織皮質(zhì)與髓質(zhì)比例變化 胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞后3d,檢測到胸腺內(nèi)腫瘤細胞密集的區(qū)域為大面積的髓質(zhì)區(qū),而注射后14d的結(jié)果顯示髓質(zhì)區(qū)明顯增加,而皮質(zhì)區(qū)卻很少。 胸腺上皮細胞變化 小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞后,梭形上皮細胞聚集并環(huán)繞在腫瘤細胞周圍,注射后16d上皮細胞非常密集并環(huán)繞腫瘤細胞殘骸形成橢圓形結(jié)構(gòu),注射后21d和28d數(shù)層鱗狀上皮細胞環(huán)繞圍成同心圓結(jié)構(gòu)包繞腫瘤細胞殘骸,注射后2個月胸腺組織恢復正常。胸腺內(nèi)注射后,在小鼠胸腺組織空隙的地方檢測到上皮細胞的富集,提示上皮細胞參與了胸腺組織的重建過程。 FCM檢測胸腺內(nèi)各類細胞亞群變化 與對照組小鼠相比,注射Hep-G2后1周的小鼠胸腺內(nèi)CD4CD8雙陽性細胞比例明顯減少,CD4CD8雙陰性細胞、CD4/CD8單陽性細胞及NKT細胞的比例有明顯升高現(xiàn)象；注射后2周檢測到調(diào)節(jié)性T細胞的比例也有增高的現(xiàn)象；注射后3周胸腺內(nèi)T淋巴細胞、NK/NKT細胞的比例未見有明顯變化； 胸腺細胞凋亡檢測 胸腺內(nèi)注射Hep-G2后1周,實驗組小鼠胸腺細胞的凋亡率有明顯升高現(xiàn)象,注射后3周凋亡率沒有明顯變化。 研究結(jié)論 1.通過對小鼠胸腺內(nèi)注射方法進行簡化,我們構(gòu)建了一種簡單的小鼠胸腺內(nèi)注射的方法用于動物實驗的研究。 2.明確了異種人肝癌細胞Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)被免疫細胞攻擊與清除的命運,并初步確定巨噬細胞、NK細胞及成熟的T淋巴細胞均參與了Hep-G2細胞的免疫攻擊與清除。 3. Hep-G2的注入,對小鼠胸腺組織造成一定的病理損傷,包括注射造成的胸腺組織機械損傷、皮質(zhì)與髓質(zhì)比例的失衡、胸腺細胞總數(shù)的減少及上皮細胞的嚴重增生等,但隨著外來腫瘤細胞的免疫清除,這些組織病理學變化也逐漸消失,小鼠胸腺組織恢復正常。 4.人肝癌細胞的人為注入,對小鼠胸腺內(nèi)T細胞發(fā)育及各類細胞亞群比例均造成一定影響,胸腺細胞凋亡比例升高,CD4CD8雙陽性細胞比例顯著減小,同時,CD4/CD8單陽性細胞、調(diào)節(jié)性T細胞及NK/NKT細胞的比例有所上升,但隨著外來腫瘤細胞的免疫清除,各類細胞亞群比例又恢復正常。
【關鍵詞】：胸腺內(nèi)注射 異種抗原 胸腺微環(huán)境 免疫耐受 MHC限制
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 符號說明15-16
• 前言16-25
• 第一部分 小鼠胸腺內(nèi)注射及注射對小鼠胸腺造成的組織病理變化分析25-42
• 1. 前言25-26
• 2. 實驗材料與儀器設備26-29
• 2.1 實驗材料26-27
• 2.2 主要試劑與其配置27-28
• 2.3 實驗儀器28-29
• 3. 實驗方法29-35
• 3.1 小鼠胸腺發(fā)育情況分析29-30
• 3.2 細胞培養(yǎng)與DⅡ標記30-31
• 3.3 小鼠胸腺內(nèi)注射方法的簡化31-32
• 3.4 注射效率評估32-33
• 3.5 小鼠損傷程度的評估33
• 3.6 組織學分析33-35
• 4. 實驗結(jié)果35-40
• 5. 討論40-42
• 第二部分 小鼠胸腺對異種抗原細胞的應答42-59
• 1. 前言42-43
• 2. 實驗材料與儀器設備43-45
• 2.1 實驗材料43
• 2.2 主要試劑及其配制43-44
• 2.3 實驗儀器44-45
• 3. 實驗方法45-47
• 3.1 腫瘤細胞培養(yǎng)與DⅡ標記45
• 3.2 小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞45
• 3.3 小鼠胸腺組織稱重及胸腺細胞絕對值計數(shù)45-46
• 3.4 組織病理學分析46
• 3.5 FCM分析胸腺內(nèi)各類細胞亞群比例變化46-47
• 4. 實驗結(jié)果47-57
• 5. 討論57-59
• 論文總結(jié)與展望59-61
• 參考文獻61-67
• 致謝67-68
• 學位論文評閱及答辯情況表68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 韓鵬;張大慶;;胸腺功能的發(fā)現(xiàn)及其對免疫學發(fā)展的影響[J];醫(yī)學與哲學;2005年13期

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本文編號：795459