本文關(guān)鍵詞：艱難梭狀芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶及二元毒素的原核表達(dá)、純化

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【摘要】：目的:艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile，CD）是院內(nèi)感染性腹瀉最主要的病原菌之一。2010年美國衛(wèi)生保健流行病學(xué)協(xié)會和感染病協(xié)會頒布針對難辨梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的臨床診治指南。英國把CDI列為強(qiáng)制上報和管理病例。國內(nèi)對于CDI報道較少，原因可能是沒有快速可靠的檢測方法，，而進(jìn)口檢測試劑價格昂貴且國家藥監(jiān)局還沒有批準(zhǔn)有關(guān)CD的任何檢測試劑。國外對CDI的檢測最常用的是酶免疫法（enzyme immunoassay，EIA）檢測谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）作為初篩，并聯(lián)合檢測毒素A/B。GDH是CD產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株的共同抗原，其產(chǎn)量高，GDH檢測靈敏度高，且出結(jié)果快速，是一種高效的初篩方法。新分離的高毒株亞型BI/NAP1/027產(chǎn)生一種新的二元毒素(Clostridium difficiletransferase，CDT)，被認(rèn)為是該毒株引起高發(fā)病和高死亡的最主要原因。CDT包括兩個獨(dú)立的蛋白亞基：具有酶活性的CDTa和具有結(jié)合能力的CDTb。最新研究表明感染產(chǎn)CDT合并TcdA和TcdB菌株的死亡率明顯高于只產(chǎn)TcdA或/和TcdB的菌株。從一定意義上證實(shí)了CDT檢測對于CD臨床病例管理，病人獲得早期及時有效的治療以及疾病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸有重要作用。目前沒有能夠同時針對GDH、毒素A/B的檢測方法，更沒有針對CDT的快速檢測方法，本課題擬通過CD標(biāo)準(zhǔn)株的厭氧培養(yǎng)，分子克隆技術(shù)構(gòu)建GDH及CDTa/b的重組表達(dá)質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化目的蛋白，通過制備GDH和CDTa/b的單克隆抗體，為CDI的快速檢測方法研究打下基礎(chǔ)。 方法:厭氧培養(yǎng)CD標(biāo)準(zhǔn)株ATCC BAA-1805，提取CD基因組DNA作為分子克隆模板。采用PCR從模板DNA中擴(kuò)增得到目的基因GDH、CDTa和CDTb，將目的基因分別克隆至表達(dá)載體pET-28a(+)，pET-32a(+)中。成功構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blot分析及Ni-NAT層析柱分離純化后，GDH蛋白根據(jù)脫氫酶酶活測定方法，測定其酶活性濃度。將純化的GDH、CDTa和CDTb免疫小鼠，檢測小鼠血清抗體效價，選擇效價高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，制備單克隆抗體。 結(jié)果:成功培養(yǎng)出艱難梭菌。通過分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28-GDH，pET-32-CDTa和pET-32-CDTb。通過原核表達(dá)技術(shù)得到目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析可見GDH在相對分子量約46kDa處，CDTa在70kDa處，CDTb在97kDa處有相應(yīng)條帶，Westernblot分析均可與抗His單抗特異性結(jié)合，經(jīng)親和層析柱純化后，GDH純度可達(dá)90%，濃度為1.7mg/ml，GDH以NADPH和NADP為輔酶，酶活性濃度分別為42.6U/L和63.3U/L。CDTa和CDTb經(jīng)純化后，伴有少量雜蛋白，CDTa和CDTb純度分別為70%和60%，濃度分別為1.3mg/ml和1.0mg/ml。純化的目的蛋白免疫小鼠后，小鼠均產(chǎn)生了抗血清，抗血清滴度為1:105。選取GDH免疫的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，遺憾的是，最終目的未能篩選出可應(yīng)用于GDH檢測的雜交瘤細(xì)胞。 結(jié)論: pET-28-GDH的重組工程菌能夠穩(wěn)定高效、可溶性地表達(dá)目的蛋白，純化的目的蛋白純度高，具有谷氨酸脫氫酶酶活性，為制備GDH單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。pET-32-CDTa與pET-32-CDTb重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量相對較少，且含有雜蛋白，可進(jìn)一步通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)溫度優(yōu)化表達(dá)條件，CDTa、CDTb可通過離子交換層析法，或通過Superdex200分子篩親和層析法優(yōu)化純化條件。
【關(guān)鍵詞】：艱難梭菌 谷氨酸脫氫酶 二元毒素 重組表達(dá) 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-17
• 1 材料與方法17-35
• 2 結(jié)果35-46
• 3 討論46-49
• 全文總結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 文獻(xiàn)綜述52-62
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 致謝62-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文63
• 攻讀學(xué)位期間參加學(xué)術(shù)會議63-64

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 羅珊;劉文恩;;艱難梭菌致病相關(guān)研究進(jìn)展[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2013年19期

本文編號：792649