發(fā)布時(shí)間：2017-09-02 01:42

  本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒A組16型減毒疫苗候選株的篩選

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【摘要】：柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)的重要病原體之一,可引起嬰幼兒發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹,亦可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等,嚴(yán)重者可致死。近年來,我國HFMD的發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的健康成長。 目前對(duì)于HFMD的治療尚無特效藥物,雖然絕大部分患者預(yù)后較好,但少數(shù)重癥病例可合并心肌炎、腦炎等。因此,疫苗是預(yù)防該類疾病最有效的手段。腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)滅活疫苗經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證保護(hù)效果十分理想,有望用于預(yù)防EV71引起的HFMD,為了能夠全面預(yù)防HFMD的發(fā)生,CA16疫苗的研發(fā)成為迫切需要解決的問題。 本研究對(duì)臨床獲得的HFMD患者的糞便及咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒的分離及鑒定,結(jié)果共獲得7株CA16病毒。對(duì)包括FY18、KMM/08、KM208在內(nèi)的10株病毒進(jìn)行研究,并將其分為兩個(gè)部分。 第一部分為生物學(xué)特性的分析。此部分對(duì)病毒的生長特性、蝕斑形態(tài)、毒力以及對(duì)乳鼠組織的病理改變等生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。10株病毒除FY18基因型為A型外,另9株均屬于Bl亞型,其中5株為Blb型、4株為B1a型；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)差異位點(diǎn),尤以第98位和第241位較典型；在Vero細(xì)胞上增殖較快,多數(shù)毒株4-6天即可達(dá)到增殖高峰,但感染性滴度相差較大,最低為4.751gCCID5o/ml,而最高可達(dá)7.781gCCID50/ml：各毒株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)相同的時(shí)間形成的蝕斑形態(tài)不一,其中KM15、KM154、KM168蝕斑呈圓形,針尖樣大小,邊緣較清晰,FY18蝕斑較上述3株病毒更加細(xì)小均勻,形狀規(guī)則,KM1、KM881、KM263、KM165、KMM/08、KM208蝕斑則較大,不規(guī)則,邊緣較模糊；各毒株毒力均較強(qiáng),乳鼠顱內(nèi)注射病毒后,均于3-6天陸續(xù)開始發(fā)病,除KM168、KM154、KM15三組乳鼠為不同程度的發(fā)病及死亡外,其他組乳鼠發(fā)病率及死亡率均達(dá)到100%；各毒株對(duì)乳鼠的腦、心、肺、肌肉、脊髓和肝臟等組織都有不同程度的損傷,其中損傷較嚴(yán)重的組織為腦和肌肉。 第二部分為減毒疫苗候選株篩選。將上述所得的10株病毒接種于KMB17細(xì)胞上經(jīng)連續(xù)低溫傳代的方式進(jìn)行減毒,通過感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性等多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)毒株進(jìn)行篩選。KM165傳代至KP2時(shí)感染性滴度仍過低(3.751gCCID50/m1),不再進(jìn)行后續(xù)研究；病毒傳代至KP4時(shí)除FY18外其余毒株毒力都有不同程度的減弱,但FY18、KM1、KM263免疫原性較差,不再進(jìn)行篩選；組織內(nèi)病毒載量測(cè)定發(fā)現(xiàn),病毒感染乳鼠后,可經(jīng)血液擴(kuò)散到全身多個(gè)組織器官,并以肌肉作為主要增殖場所,通過腸道排出體外；至KP7時(shí),剩余的6株病毒感染性滴度均大于6.001gCCID50/m1,KM154、KM168則大于7.001gCCID50/m1,均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體;后經(jīng)蝕斑克隆純化獲得73個(gè)克隆株,根據(jù)感染性滴度、抗原含量、免疫原性、對(duì)乳鼠的殘余毒力及前期的研究結(jié)果初步篩選出KP11的KM168-8、KM154-62個(gè)克隆株作為候選株進(jìn)行后續(xù)的研究。因此下一步還需要對(duì)這2個(gè)克隆株進(jìn)行二次克隆純化篩選,同時(shí)進(jìn)行感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性系統(tǒng)性研究以建立真正符合要求的減毒疫苗候選株。
【關(guān)鍵詞】：手足口病 柯薩奇病毒A組16型 生物學(xué)特性 減毒活疫苗
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-19
• 一 HFMD及CA16流行情況10-12
• 二 CA16基因結(jié)構(gòu)及其分型12-13
• 三 病毒感染與繁殖13-14
• 四 臨床癥狀及致病機(jī)制14-15
• 五 HFMD的藥物治療及預(yù)防15-16
• 六 CA16疫苗研究現(xiàn)狀16-17
• 七 課題研究目的、意義和思路17-19
• 材料與方法19-31
• 一 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2 毒株19
• 3 樣品及細(xì)胞來源19
• 4 主要試劑及配制方法19-22
• 5 所用材料22
• 6 主要儀器22-23
• 二 實(shí)驗(yàn)方法23-31
• 1 細(xì)胞培養(yǎng)23
• 2 病毒分離23-24
• 3 病毒培養(yǎng)24
• 4 病毒鑒定24-25
• 5 感染性滴度檢測(cè)及病毒生長特性分析25-26
• 6 ELISA檢測(cè)CA16抗原含量(雙平行線法)26
• 7 病毒蝕斑形態(tài)分析26-27
• 8 病毒致病性檢測(cè)27
• 9 免疫原性檢測(cè)27-28
• 10 乳鼠組織內(nèi)病毒載量的測(cè)定28-31
• 結(jié)果與分析31-51
• 一 CA16生物學(xué)特性分析31-40
• 1 病毒分離及鑒定情況31-36
• 2 病毒生長特性分析36-37
• 3 病毒蝕斑形態(tài)分析37-38
• 4 病毒致病性評(píng)價(jià)38-40
• 二 CA16減毒疫苗候選株篩選40-51
• 1 35℃低溫傳代40-42
• 2 33℃低溫傳代42-51
• 討論51-55
• 一 CA16生物學(xué)特性分析51-53
• 二 CA16減毒疫苗候選株篩選53-55
• 小結(jié)55-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 縮略詞表61-62
• 致謝62-63
• 個(gè)人簡歷63-64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：775670