本文關鍵詞：高變區(qū)1中和表位在HCV免疫逃逸中的作用

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【摘要】：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一種有包膜的單正鏈RNA病毒，隸屬于黃病毒科，丙型肝炎病毒屬；主要經(jīng)血傳播，是引起急、慢性肝炎的重要病原體之一。HCV感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，目前全球HCV感染者約為1.6億，每年新增感染者約有二百萬。高達80%的HCV感染者發(fā)展為慢性感染，HCV慢性感染是引起肝硬化、肝細胞癌的重要原因之一。此外，HCV慢性感染還與多種肝外疾病，如糖尿病、淋巴瘤、腎小球腎炎、混合性冷球蛋白血等癥相關。 HCV RNA聚合酶無校對功能，致使其基因組在復制過程中易產(chǎn)生突變。根據(jù)基因組核苷酸序列的異質性，HCV被分為7個不同的基因型，每個基因型又被分為若干亞型。受各蛋白在HCV復制周期中功能的限制，HCV基因組中的變異呈現(xiàn)明顯的不平衡分布。HCV各蛋白中，以包膜蛋白的變異性最高，這由包膜蛋白是誘導中和抗體的靶抗原的特性所決定。HCV包膜蛋白由E1和E2兩個亞基通過非共價鍵形成異源二聚體所構成，其中位于E2氨基末端的27個氨基酸殘基是包膜蛋白中變異頻率最高的區(qū)域，該區(qū)域被稱為高變區(qū)1（hypervariableregion1, HVR1）。HVR1是最早發(fā)現(xiàn)的HCV中和表位所在區(qū)域，該區(qū)域的變異被認為是HCV免疫逃逸和持續(xù)感染的重要原因，也是丙肝疫苗研發(fā)一直面臨的瓶頸。HVR1高度暴露于HCV包膜蛋白的表面，是病毒與B類I型清道夫受體（scavenger receptor class B type I, SR BI）作用的關鍵區(qū)域，高密度脂蛋白（HDL）增強HCV的細胞侵入依賴于HVR1的存在，因而HVR1在HCV的細胞入侵過程中起重要作用。 HCV患者外周血以及細胞培養(yǎng)體系中的HCV顆粒表面均不同程度結合有脂蛋白，這使得HCV顆粒呈現(xiàn)低密度特性以及明顯的密度不均一性。HCV顆粒的感染性與其密度負相關，這提示HCV顆粒表面結合的脂蛋白有助于增強HCV的感染性。最近有研究顯示，HVR1參與調節(jié)HCV顆粒與脂蛋白的結合，從而影響HCV的感染性與逃逸中和免疫。 綜上，HVR1在HCV的感染和免疫逃逸中起重要調控作用。我們前期在1a型的H77株，1b型的Con1株HCV包膜蛋白的HVR1中均分別鑒定出三個相對獨立的不同微功能域：感染決定區(qū)，決定HCV包膜蛋白與SR BI受體的結合，該區(qū)的缺失導致HCV假病毒顆粒（HCV pseudotyped particles, HCVpp）的感染性徹底喪失，缺失該區(qū)的單個氨基酸殘基能降低HCVpp感染性的70%以上，但單個氨基酸殘基的替換突變并不明顯改變HCVpp的感染性；感染調節(jié)區(qū)，刪除該區(qū)域僅有限降低HCVpp的感染性，該區(qū)域內的突變可改變HCVpp的感染性；多功能區(qū)，為HVR1中的中和表位，刪除該區(qū)增強或有限降低HCVpp的感染性，但消除了HDL對HCV細胞入侵的增強作用以及肝素與E2的結合活性，并增強E2抗體的中和活性。 本研究中，我們根據(jù)H77原型株HCV患者血清HVR1序列歷經(jīng)13年以后的變異情況對我們上述的HVR1功能分區(qū)進行再次評價，并用細胞培養(yǎng)來源的HCV（HCV derived from cell culture, HCVcc）為模型進一步探討多功能區(qū)，即中和表位的其他功能，本研究結果推進了對HCV逃避體液免疫應答機制的認識，并為HCV疫苗的研發(fā)提供了新思路。 第一部分H77株HCV HVR1間隔13年后的序 列變異對其功能的影響 美國NIH Purcell教授對一名于1977年初次診斷為經(jīng)血傳播的非甲非乙型肝炎患者（后證實是HCV感染）在急性期以及慢性期多個時間點的HCV基因進行了克隆和測序，使該患者的血清序列成為HCV變異、中和免疫等研究的經(jīng)典材料。前期我們以該患者1977年急性期的E1E2序列（H77株）中的HVR1進行的功能研究顯示，在該株病毒的HVR1中存在三個相對獨立的微功能域；本研究中，我們分析了該患者歷經(jīng)13年以后，即1990年從該患者血清擴增出的E1E2（H90株）中HVR1序列變異對其免疫原性和包裝出的HCVpp感染性的影響。比較H77株的HVR1序列（ETHVTGGSAG HTTAGLVGLLTPGAKQN）與H90株HVR1序列（ETHVTGGSAG HSVLGIASFLTRGPKQN），發(fā)現(xiàn)共有9個氨基酸（aa1214、aa1619、aa22、aa24）發(fā)生了突變。我們在H77株E1E2序列中分別引入三種突變：突變1，將H90株HVR1的aa1214引入H77株HVR1；突變2，將H90株HVR1的aa1619、aa22及aa24引入H77株HVR1；突變3，將H90株HVR1的全部9個氨基酸突變引入H77株HVR1。比較三種HVR1突變的E1E2與H77株原型E1E2在293T細胞內的表達水平、組裝產(chǎn)生假病毒顆粒的效率、HCVpp的感染性以及H77株HVR1抗體對各假病毒的中和活性。 分別將三種突變質粒與H77株E1E2質粒轉染293T細胞，Western blot檢測顯示HVR1突變的E1E2與H77株E1E2的表達水平無明顯差異，組裝產(chǎn)生假病毒顆粒的效率相似，但各假病毒的感染性及H77HVR1抗體對各假病毒的中和活性各異。由突變質粒1轉染293T細胞而制備的HCVpp的感染性為H77株的70%，其感染性能被H77株HVR1抗體中和；由突變質粒2轉染制備的HCVpp的感染性為H77株的140%，H77株HVR1抗體對其無中和活性；由突變質粒3轉染制備的HCVpp的感染性為H77株的90%，H77株HVR1抗體對其無中和活性。前期研究中，我們在H77HVR1中鑒定出aa113為感染調節(jié)區(qū)，刪除該區(qū)的氨基酸殘基僅部分影響HCVpp的感染性；aa1415以及aa2527共同組成感染決定區(qū)，刪除該區(qū)的氨基酸殘基顯著降低HCVpp的感染性，但該區(qū)的點突變僅有限降低HCVpp的感染性；aa1624為中和表位，也稱為多功能區(qū)。本部分實驗中的突變1對H77HVR1的aa1214進行了突變，這三個點突變均位于先前鑒定出的中和表位以外，其中aa12和aa13位于我們先前鑒定出的感染調節(jié)區(qū)，aa14位于感染決定區(qū)，突變1相應HCVpp的感染性僅部分降低，且能被H77HVR1抗體中和；突變質粒2中的6個點突變均位于HVR1中和表位中，相應HCVpp的感染性明顯增強，且不能被H77HVR1抗體中和；突變質粒3含有H90HVR1的全部9個點突變，對應HCVpp的感染性為H77的90%，且也不能被H77HVR1抗體中和。此外，H90株HVR1抗體能中和突變2和突變3對應HCVpp的感染，但不能中和H77及突變1對應HCVpp的感染。這些結果均與我們先前鑒定的H77HVR1三個微域各自的功能相符。H90株HVR1序列的變異提示HVR1在進化過程中體現(xiàn)了各位點殘基變異的隨機性與維持HVR1介導免疫逃避與細胞侵入的協(xié)調統(tǒng)一。 第二部分HVR1中和表位對HCV密度以及感染特性的影響 用HCVpp為模型我們觀察到HVR1中的中和表位是HDL增強HCV感染性的關鍵結構域，并且能保護HCV抵制E2抗體的中和作用，由此可見該區(qū)域在HCV免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。HCVpp由293T細胞產(chǎn)生，其表面沒有脂蛋白，與真正HCV病毒顆粒的細胞侵入特性并不完全相同，本部分的研究中，我們用HCVcc模型驗證在HCVpp模型上獲得的結果，并進一步觀察該表位對HCV顆粒細胞侵入特性的影響。我們分別制備了刪除HVR1和HVR1中和表位的J6/JFH1嵌合株HCVcc，結果顯示兩種缺失突變的HCVcc的感染性均下降為野生型的10%左右，且這兩種突變HCVcc的感染性分布和密度分布呈現(xiàn)出十分相似的趨勢，感染性病毒顆粒的分布均向高密度層偏移，且HDL對兩種突變HCVcc的感染性均不產(chǎn)生影響。 此前已有報道完全刪除HVR1導致低密度HCVcc的分布下調以及高密度HCVcc的感染性上調，那么，僅刪除中和表位引起HCV密度和感染性發(fā)生類似改變的機制何在？我們通過密度梯度離心分離出J6/JFH1嵌合HCVcc的低密度與高密度顆粒，觀察HDL對不同密度顆粒感染性的影響，結果顯示HDL不影響低密度HCVcc顆粒的感染性，但增強高密度HCVcc顆粒的感染性。分別檢測HVR1多克隆抗體以及針對E2蛋白中HVR1以外區(qū)域（E2HVR1）的多克隆抗體對不同密度病毒的中和活性，結果顯示，HVR1抗體對低密度HCV顆粒的中和活性強于對高密度顆粒的中和活性。與此相反，E2HVR1抗體對高密度病毒的中和活性高于對低密度病毒的中和活性。用HCV受體SR BI和CD81的多抗進行感染阻斷，結果顯示，SR BI抗體對低密度病毒感染的阻斷作用強于對高密度病毒的阻斷作用，而CD81抗體對不同密度病毒的阻斷作用相似。用高密度、低密度病毒顆粒分別感染用SR BI shRNA慢病毒感染的Huh7.5.1細胞，也觀察到類似結果。進一步我們分別觀察SR BI、CD81抗體對刪除了整個HVR1或HVR1中和表位的HCVcc的阻斷作用，結果顯示，SR BI抗體對兩種突變HCVcc均無阻斷作用，而CD81多抗對這兩種突變HCVcc以及野生型HCVcc的阻斷作用相似。這提示不同密度的病毒顆粒對受體的利用率有所差異，低密度病毒顆粒傾向于通過表面暴露的HVR1與SR BI受體的作用啟動細胞侵入，而高密度病毒顆粒則可通過包膜蛋白與CD81受體的直接作用啟動侵入。 以上結果提示SR BI為HCVcc入侵宿主細胞的一個可備選的受體，HCV利用HVR1中的中和表位增強其與低密度脂蛋白的作用，從而增強其與SR BI受體的作用，避免與CD81受體的即刻作用，這對于HCV的免疫逃逸具有重要意義。 小結 1.我們先前以一例1a型HCV原型株患者在急性期以及慢性期多個時間點的HCV基因克隆和測序的結果為材料鑒定出HVR1中存在三個不同的微功能區(qū)。歷經(jīng)13年以后，該感染者HCV HVR1中的9個氨基酸發(fā)生突變，其中兩個氨基酸突變位于感染調節(jié)區(qū)，，一個氨基酸突變位于感染決定區(qū)，6個氨基酸突變位于中和表位中。我們檢測這些突變對HCVpp感染性以及HVR1抗體中和活性的影響，結果顯示，感染調節(jié)區(qū)和感染決定區(qū)中三個氨基酸的突變（aa1214）導致實驗條件下HCVpp的感染性降低30%，但不影響H77HVR1抗體的中和活性；中和表位中6個氨基酸的突變（aa1619、aa22、aa24））導致HCVpp感染性升高40%，并且消除H77HVR1抗體的中和作用；突變全部9個氨基酸導致HCVpp感染性降低10%以及H77HVR1抗體中和活性的消失。這些結果提示HVR1的進化是不同位點隨機突變與HVR1整體功能進化（即保持HCV感染性的同時實現(xiàn)免疫逃逸）的協(xié)調統(tǒng)一。 2.觀察不同密度HCV病毒顆粒對受體利用的差異性，結果顯示，低密度HCVcc顆粒主要利用暴露于病毒表面的HVR1與靶細胞SR BI受體作用啟動入侵，而高密度HCVcc顆粒則可通過暴露于病毒表面的包膜蛋E2直接與CD81結合；刪除HVR1的HCVcc顆粒侵入肝細胞不再依賴于SR BI，但對CD81的依賴沒有改變；HCV HVR1通過中和表位與脂蛋白作用，不僅增強了HCV的感染性，而且避免病毒與CD81受體的like作用，從而保護HCV抵抗E2抗體的中和。本研究在我們先前研究的基礎上進一步揭示了HCV HVR1中和表位在HCV細胞侵入和免疫逃逸中的重要作用，推進了對HCV持續(xù)性感染機制的認識，并為HCV感染防治藥物與疫苗的研發(fā)提供了新的思路。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒 HVR1 免疫逃逸 感染性
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要5-10
• Abstract10-15
• 英文縮略詞表15-18
• 第一部分18-35
• 一、前言18-20
• 二、材料20-25
• 三、方法25-29
• 四、結果29-33
• 五、討論33-35
• 第二部分35-55
• 一、前言35-36
• 二、材料36
• 三、方法36-39
• 四、結果39-52
• 五、討論52-55
• 參考文獻55-59
• 文獻綜述59-69
• 參考文獻65-69
• 附錄69-71
• 致謝71-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：765457