本文關(guān)鍵詞：電離輻射誘導(dǎo)線粒體相關(guān)基因表達(dá)的改變及相互作用的研究

  更多相關(guān)文章： ~60Coγ射線 人淋巴細(xì)胞 人正常肝細(xì)胞 線粒體基因表達(dá) 相互作用

【摘要】：目的： 線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)的場所,線粒體DNA是細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì),編碼37個基因(22個tRNA基因、2個rRNA基因和13個多肽基因),參與細(xì)胞OXPHOS和能量代謝且合成ATP,為細(xì)胞的生命活動提供直接能量。 目前發(fā)現(xiàn)線粒體基因組相比于核基因組的拷貝數(shù)高,復(fù)雜程度低,對電離輻射也更加敏感。線粒體功能的實現(xiàn)受到核基因組的調(diào)控,同時核基因組和線粒體基因組相互協(xié)調(diào)維持細(xì)胞內(nèi)正常的ATP水平。在本實驗室前期對電離輻射誘導(dǎo)的線粒體編碼基因表達(dá)變化研究中,發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導(dǎo)的COX基因(由3個線粒體編碼基因和10個核基因組編碼基因組成)表達(dá)變化比較明顯,為研究電離輻射誘導(dǎo)的核基因組和線粒體基因組相互作用提供了科學(xué)依據(jù)。 本課題就是探索電離輻射誘導(dǎo)人正常細(xì)胞的線粒體編碼基因COX Ⅰ、 COX Ⅱ與線粒體相關(guān)核編碼基因NRF-1、mtTFA、COXⅣ、COXVb的表達(dá)變化,進(jìn)而觀察mtTFA敲低后這些基因表達(dá)改變,并探討與細(xì)胞活性和ATP濃度之間的關(guān)系,初步探索電離輻射誘導(dǎo)線粒體基因組與核基因組之間的相互作用,為了解電離輻射誘導(dǎo)的分子生物效應(yīng)提供新的實驗資料,為輻射損傷敏感標(biāo)志物的篩選提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1.以劑量率為1Gy/min的60Coγ射線(劑量為0、1、3、5、8、10和15Gy)對人淋巴細(xì)胞株AHH-1和人正常肝細(xì)胞株L02進(jìn)行照射,照射后培養(yǎng)24h和48h,分析COX Ⅰ、COX Ⅱ、NRF-1、mtTFA、COXⅣ、COXⅤb的表達(dá)變化。用實時熒光定量PCR的方法分析轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化,用Western blot檢測其蛋白水平的變化。AHH-1測定細(xì)胞活性；L02測定ATP濃度和細(xì)胞活性。 2.用RNA干擾技術(shù)敲低mtTFA后,不同劑量(0-15Gy)60Coγ射線照射L02肝細(xì)胞,24h、48h后用實時熒光定量PCR的方法檢測線粒體基因NRF-1、 mtTFA、COX Ⅰ、COX Ⅱ、COXⅣ、COX Ⅴb的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化；Western blot檢測敲低前后其蛋白水平表達(dá)變化；同時測定ATP濃度和細(xì)胞活性。 結(jié)果： 1.60Coγ射線照射人淋巴細(xì)胞AHI-I-1后,COX Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平在24h、48h的0-5Gy范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的劑量效應(yīng)關(guān)系；COX Ⅱ轉(zhuǎn)錄水平在24h的0-15Gy表達(dá)水平顯著增強(qiáng),呈現(xiàn)較好的劑量效應(yīng)關(guān)系；mtTFA轉(zhuǎn)錄水平在24h、48h的0-15Gy呈現(xiàn)較好的劑量效應(yīng)關(guān)系；其他基因COXIV、COXⅤb、NRF-1表達(dá)變化不明顯。 2.60Coγ射線照射人正常肝細(xì)胞L02后,相比于對照組的24h、48h mRNA水平,NRF-1、mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ、COXⅣ、COXⅤb總體上調(diào),均具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)在24h的0～10Gy范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系,10Gy劑量水平誘導(dǎo)的表達(dá)增強(qiáng)最顯著：COXⅣ和COXⅤb轉(zhuǎn)錄水平農(nóng)達(dá)在0-5Gy范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系,5Gy劑量水平誘導(dǎo)的表達(dá)增強(qiáng)最顯著：COXⅠ基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)在48h的0-8Gy范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系,8Gy表達(dá)增強(qiáng)最顯著。照射后24h的蛋白水平分析,mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ總體上調(diào),均具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系;48h蛋白水平分析,mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ總體上調(diào),但劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯； 3.用RNA干擾技術(shù)成功敲低L02的mtTFA后,相比于對照組的照射24h、48h后mRNA水平,NRF-1、mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ、COXⅣ、COXⅤb總體上調(diào);但相比于未敲低之前,COX Ⅰ、COX Ⅱ mRNA水平降低,COXⅣ、COX Vb mRNA水平上調(diào),NRF-1表達(dá)變化不明顯；L02照射后ATP濃度隨劑量增加,濃度升高,細(xì)胞活性下降；而用RNA干擾技術(shù)敲低mtTFA后,ATP濃度隨劑量增加,濃度升高,但相比未敲低組,ATP濃度下降。 結(jié)論： 1.在轉(zhuǎn)錄水平上,60Coγ射線照射后24h和48h,人正常肝細(xì)胞線粒體基因NRF-1、mtTFA、COX Ⅰ、COXⅡ、COXⅣ、COXⅤb表達(dá)水平總體上調(diào),6種線粒體基因均有各自不同的最佳誘導(dǎo)劑量； 2.電離輻射誘導(dǎo)的L02線粒體基因在調(diào)控通路上,mtTFA調(diào)控線粒體編碼的基因COX Ⅰ、COXⅡ而不參與調(diào)控核基因編碼的COXⅣ、COXⅤb,需進(jìn)一步研究NRF-1調(diào)控核基因編碼的通路。 3.電離輻射誘導(dǎo)L02細(xì)胞ATP濃度隨著劑量增加而增加,而RNA干擾mtTFA后,其ATP濃度隨著劑量增加而增加,但相比于RNA干擾前(?)ntTFA下降比較明顯,可能受線粒體編碼的基因COX Ⅰ、COX Ⅱ下調(diào)影響。 本研究在揭示了電離輻射誘導(dǎo)的線粒體基因與核基因表達(dá)基礎(chǔ)上,確定了輻射對人正常肝細(xì)胞的殺傷作用以及時間響應(yīng)范圍；利用小RNA瞬時敲低mtTFA COX Ⅰ、COX Ⅱ表達(dá)也隨之下調(diào),同時引起細(xì)胞ATP濃度的降低,并導(dǎo)致細(xì)胞活性異常,證明了mtTFA在電離輻射誘導(dǎo)下是作為COX Ⅰ、COX Ⅱ的上游調(diào)控基因；核編碼的基因mtTFA以及線粒體編碼的基因COX Ⅰ、COX Ⅱ在影響ATP濃度的改變中發(fā)揮重要作用,提供了提高輻射敏感性研究的資料；同時由于凋亡的發(fā)生與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡是治療腫瘤的重要方法之一,提示通過敲低肝癌細(xì)胞的線粒體基因來提高腫瘤放射敏感性。
【關(guān)鍵詞】：~60Coγ射線 人淋巴細(xì)胞 人正常肝細(xì)胞 線粒體基因表達(dá) 相互作用
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略詞表12-14
• 前言14-21
• 材料與方法21-37
• 1. 實驗材料21-27
• 1.1 材料及試劑配制方法21-22
• 1.2 主要試劑22-23
• 1.3 試劑配方23-26
• 1.4 儀器設(shè)備26-27
• 2. 實驗方法27-37
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代27
• 2.2 細(xì)胞株外照射及計數(shù)27-28
• 2.3 RNA干擾28
• 2.4 質(zhì)粒DNA的大量制備28-29
• 2.5 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染29-30
• 2.6 細(xì)胞總RNA的提取30
• 2.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR30-32
• 2.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測32
• 2.9 實時熒光定量PCR32-33
• 2.10 細(xì)胞蛋白樣品處理33
• 2.11 Western Blot印跡法33-35
• 2.12 細(xì)胞活性及ATP濃度測定35-36
• 2.13 統(tǒng)計學(xué)處理36-37
• 結(jié)果37-57
• 第一部分 ~(60)Coγ照射后人淋巴細(xì)胞線粒體基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化37-43
• 第二部分 ~(60)Coγ照射后人正常肝細(xì)胞線粒體基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化43-51
• 第三部分 ~(60)Coγ照射后人正常肝細(xì)胞線粒體基因在翻譯水平上的表達(dá)變化51-55
• 第四部分 ~(60)Coγ照射后人淋巴細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞的ATP濃度和細(xì)胞活性55-57
• 討論57-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69
• 綜述：microRNA作為電離輻射生物標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀69-79
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 作者簡介79

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：764830