發(fā)布時間：2017-08-30 15:49

  本文關(guān)鍵詞：乙酰膽堿受體的重組表達(dá)以及抗AChR抗體檢測方法的建立

  更多相關(guān)文章： 重癥肌無力 乙酰膽堿受體 EAMG 抗-AChR抗體 放射免疫法 基因表達(dá)

【摘要】：重癥肌無力（MG）是一種對神經(jīng)肌接頭處煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinicacetylcholine receptor，nAChR）產(chǎn)生免疫反應(yīng)的自身免疫性疾病�？筺AChR抗體激活的補體攻擊反應(yīng)可以導(dǎo)致nAChR甚至突觸后膜的破壞，從而引起神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)功能障礙。 煙堿型乙酰膽堿受體為配體門控離子通道超家族成員之一，在神經(jīng)肌肉接頭中的突觸后膜上介導(dǎo)化學(xué)信號向電信號的快速轉(zhuǎn)化。這一家族蛋白包括甘氨酸受體、γ-氨基丁酸受體、谷氨酸受體及5-羥色胺受體。電鰩電器官及骨骼肌中的nAChR為較大的（Mr約290kDa）四種同源亞基組成的五聚體，電鰩及胚胎肌肉中為α12β1δγ，成人肌肉中為α12β1δε。亞基按α1-γ-α1-δ-β1的順序形成一個圓柱形離子通道復(fù)合體。每個亞基都是一條多肽鏈，從N端到C端依次為：1個較大的N-末端胞外域（extracellular domain， ECD），3個跨膜域，1條較大的胞內(nèi)環(huán)，第4個跨膜域和1個C-端尾位于胞外。nAChR N-末端胞外域?qū)κ荏w激動劑及競爭性拮抗劑都具有較高的親和力。神經(jīng)遞質(zhì)ACh主要作用在α1γ亞基和α1δ亞基交界處的兩個不對等位點，而α-銀環(huán)蛇毒素（α-Bungarotoxin，，α-BTx）與nAChR的結(jié)合位點則主要是α1亞基N-末端胞外域。并且，α1亞單位胞外域還包括了主要免疫原區(qū)（main immunogenicregion， MIR），是刺激重癥肌無力患者形成nAChR抗體的主要位點。外源注射nAChR能使動物產(chǎn)生nAChR抗體，并表現(xiàn)出重癥肌無力癥狀，即免疫重癥肌無力主動免疫動物模型。將來還有可能將nAChR用于結(jié)合重癥肌無力患者血清內(nèi)的致病抗體，從而達(dá)到去除致病抗體，緩解臨床癥狀。 有研究稱，利用放射免疫法（RIA）檢測MG患者血清抗-AChR抗體含量，以此作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，其診斷敏感性為88%，且不同MG分型的陽性率也有所區(qū)別：早發(fā)眼肌型MG為71%，晚發(fā)眼肌型為88%，早發(fā)全身型為89%，晚發(fā)全身型為98%。而抗-AChR抗體陽性診斷MG的特異性高達(dá)99.9%。但是，目前國內(nèi)沒有將檢測抗-AChR抗體作為常規(guī)診斷方法，通過我們的研究，我們成功建立了穩(wěn)定的抗-AChR抗體放射免疫檢測法，并希望該方法能與臨床診斷相結(jié)合，提高MG診斷效率。 實驗性自身免疫性重癥肌無力（Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）是發(fā)生在大鼠身上的，T細(xì)胞依賴的抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，且整個免疫過程是單純針對nAChR的免疫反應(yīng)。作為研究重癥肌無力的重要研究手段，EAMG模型的構(gòu)建依然是我們研究該領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)。目前構(gòu)建EAMG模型的原材料主要有兩種：一種是電鰩電器官，一種是哺乳動物的去神經(jīng)支配肌肉。目前在國內(nèi)，電鰩價格昂貴且難以獲取，而大鼠去神經(jīng)支配術(shù)復(fù)雜且獲取量少，所以我們考慮用重組表達(dá)nAChR的方法獲得穩(wěn)定且具有生物學(xué)活性的蛋白。本實驗共嘗試了兩種方法表達(dá)nAChR：①C HO細(xì)胞表達(dá)人乙酰膽堿受體α亞單位胞外域。以nAChR α1基因全長為模板，PCR法擴增nAChR α1亞基ECD1-216，酶切后裝入pcDNA3.1表達(dá)載體中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后6~72h的7個時間點進行熒光實時定量PCR鑒定ECD基因的表達(dá)水平，利用125I標(biāo)記的銀環(huán)蛇毒素測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中ECD蛋白的表達(dá)。②大腸桿菌表達(dá)含三個突變堿基的大鼠乙酰膽堿受體α亞單位胞外域。將大鼠AChRα1亞基胞外域蛋白中三個氨基酸進行突變，分別為Val8Glu，Trp149Arg，Val155Ala，送公司合成上述基因。將合成基因插入pET-22b載體中，然后在Bl-21菌株中大量表達(dá)。鑒定表達(dá)正確的蛋白用溶液稀釋法進行蛋白復(fù)性。 綜上所述，本實驗嘗試可通過真核或原核細(xì)胞表達(dá)重組nAChR的方法來替代來源短缺的天然nAChR，同時建立快捷、簡便的抗nAChR抗體檢測方法，提高臨床MG的診斷效率。
【關(guān)鍵詞】：重癥肌無力 乙酰膽堿受體 EAMG 抗-AChR抗體 放射免疫法 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R746.1;R392
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-27
• 第一部分 AChR 的提取27-33
• 1 材料27-28
• 1.1 主要試劑27
• 1.2 主要試劑的配制27-28
• 1.3 實驗材料準(zhǔn)備28
• 1.4 主要儀器28
• 2 方法28-30
• 2.1 大鼠的去神經(jīng)支配術(shù)28-29
• 2.2 大鼠 AChR 的粗提29
• 2.3 人 AChR 的粗提29-30
• 2.4 BCA 法檢測大鼠及人 AChR 粗提物的濃度30
• 3 結(jié)果30-32
• 3.1 去神經(jīng)支配術(shù)后大鼠的臨床表現(xiàn)30-31
• 3.2 乙酰膽堿受體的濃度31-32
• 4 討論32-33
• 第二部 抗 AChR 抗體檢測方法的建立33-39
• 1 材料33-34
• 1.1 主要試劑33
• 1.2 主要試劑的配制33
• 1.3 實驗材料準(zhǔn)備33-34
• 2 方法34-36
• 2.1 兔抗人 IgG 抗體的制備34-35
• 2.2 放射免疫法檢測抗 AChR 抗體方法的建立35
• 2.3 放射免疫法檢測患者血清中 AChR 抗體35-36
• 3 結(jié)果36-38
• 3.1 免疫雙擴實驗結(jié)果36
• 3.2 放射免疫實驗方法的建立36-37
• 3.3 放射免疫法檢測患者血清中 AChR 抗體37-38
• 4 討論38-39
• 第三部分 真核重組表達(dá)人 nAChRα1 亞單位胞外域39-50
• 1 材料39-41
• 1.1 載體質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞39
• 1.2 主要試劑39
• 1.3 主要試劑的配制39-40
• 1.4 主要儀器40-41
• 2 方法41-46
• 2.1 人 AChR α1 亞單位胞外域基因的合成41-42
• 2.2 pcDNA3.1-ECD 載體構(gòu)建42-44
• 2.3 CHO-k1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染44-45
• 2.4 熒光實時定量 PCR 法檢測目的基因的表達(dá)45
• 2.5 放射免疫沉淀法檢測蛋白的表達(dá)45-46
• 3 結(jié)果46-48
• 3.1 真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-ECD 的鑒定46
• 3.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果46-47
• 3.3 熒光實時定量 PCR 結(jié)果47-48
• 3.4 放射免疫法檢測 ECD 蛋白表達(dá)量及蛋白的生物學(xué)活性48
• 4 討論48-50
• 第四部分 原核重組表達(dá)三個堿基突變的 nAChRα1 胞外域蛋白50-63
• 1 材料50-53
• 1.1 載體質(zhì)粒及菌株50
• 1.2 主要試劑50-51
• 1.3 主要試劑的配制51-53
• 1.4 主要儀器53
• 2 方法53-59
• 2.1 pET22b-mα1tmECD 載體的構(gòu)建53-56
• 2.2 pET22b-mα1tmECD 的原核表達(dá)56-57
• 2.3 pET22b-mα1tmECD 蛋白的純化與復(fù)性57-59
• 3 結(jié)果59-61
• 3.1 pET22b-mα1tmECD 重組質(zhì)粒鑒定59-60
• 3.2 SDS-PAGE 鑒定 mα1tmECD 蛋白的表達(dá)60
• 3.3 蛋白復(fù)性條件的優(yōu)化60-61
• 4 討論61-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 個人簡歷和研究成果71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉偉,劉國津,范志民,蓋學(xué)良;Myasthenia gravis in pediatric and elderly patients[J];Chinese Medical Journal;2003年10期

本文編號：760213