本文關(guān)鍵詞：GSK3β對Drp1磷酸化調(diào)節(jié)的機(jī)制及其功能的研究

  更多相關(guān)文章： GSK3β Drp1 線粒體 阿茲海默綜合癥 學(xué)習(xí)與記憶

【摘要】：線粒體的動態(tài)平衡是指線粒體處于不斷分裂和融合的穩(wěn)態(tài)中,此過程主要受分裂蛋白Drp1、Fis1及融合蛋白MFN1/2、OPA1所調(diào)控。相關(guān)的研究證實(shí),在神經(jīng)退行性疾病尤其是阿茲海默綜合癥(AD)及亨廷頓舞蹈癥(HD)中,神經(jīng)元的動態(tài)平衡受損從而導(dǎo)致線粒體呈過度分裂狀態(tài),進(jìn)而影響神經(jīng)元內(nèi)的ATP產(chǎn)生、凋亡信號的釋放并導(dǎo)致突觸功能的減退。但是,線粒體過度分裂的分子機(jī)制仍不清楚。糖原合成酶激酶3β (GSK3β)是神經(jīng)元中一種重要的激酶,廣泛參與神經(jīng)元的發(fā)育、分化、凋亡等各個(gè)方面,對于神經(jīng)元正常功能的維持至關(guān)重要。近年的研究顯示,GSK3β活性的異常升高可能是導(dǎo)致AD發(fā)生的關(guān)鍵因素。而其中,GSK3β是否可以調(diào)節(jié)線粒體的動態(tài)平衡并導(dǎo)致疾病的發(fā)生對于AD發(fā)病機(jī)制的研究具有非常重要的價(jià)值。先前的相關(guān)研究證實(shí),真菌中GSK3β與Drp1存在蛋白間的相互作用,提示GSK3β與Drp1的相互作用可能存在于神經(jīng)元中,并可能對神經(jīng)元功能的維持發(fā)揮重要作用。 為了研究GSK3β能否通過Drp1來調(diào)控神經(jīng)元中線粒體的動態(tài)平衡,我們設(shè)計(jì)了一系列免疫熒光及蛋白印跡的實(shí)驗(yàn)研究具體的分子機(jī)制,并建立小鼠的行為學(xué)模型觀察干預(yù)兩分子結(jié)合后對其學(xué)習(xí)與記憶能力的影響,闡明了GSK3β與Drp1的相互作用在AD發(fā)生中可能起到的作用。研究結(jié)果如下： 1. GSK3β活性升高促進(jìn)線粒體的分裂 在體外培養(yǎng)7天的神經(jīng)元中,與對照組相比,過表達(dá)GSK3β會導(dǎo)致線粒體變短,同時(shí)含有分裂狀態(tài)線粒體的神經(jīng)元比例顯著上升；而用GSK3β抑制劑AR-A014418處理會導(dǎo)致線粒體變長,同時(shí)含有分裂狀態(tài)線粒體的神經(jīng)元顯著下降。 2.Drp1參與GSK3β調(diào)控的線粒體過度分裂 用小干擾RNA抑制Drp1表達(dá)之后,GSK3β無法誘導(dǎo)線粒體的分裂,證明GSK3β調(diào)控線粒體分裂是依賴于Drp1的。并通過免疫共沉淀與免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3.Drp1上40及44位絲氨酸的磷酸化控制GSK3β調(diào)控的線粒體過度分裂 首先用生物信息學(xué)方法預(yù)測Drp1上GSK3β磷酸化的潛在位點(diǎn),并通過分子克隆技術(shù)對分值較高的位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變,模擬該位點(diǎn)持續(xù)磷酸化及持續(xù)去磷酸化的狀態(tài)；然后用觀察線粒體形態(tài)的方法尋找實(shí)際的位點(diǎn)。經(jīng)過形態(tài)學(xué)的觀察,確定Drp1上40及44位的絲氨酸被GSK3β磷酸化之后,可明顯促進(jìn)線粒體的分裂。 4.Drp1上40及44位絲氨酸通過不同的分子機(jī)制被GSK3β磷酸化 為了確定兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化的機(jī)制,首先制備了針對兩個(gè)位點(diǎn)的特異性磷酸化抗體并驗(yàn)證其效率；隨后用特異性磷酸化抗體確定Drp1上44位絲氨酸可被GSK3β直接磷酸化,而40位絲氨酸需要44位絲氨酸先被磷酸化為基礎(chǔ)。 5.Drp1磷酸化導(dǎo)致其GTPase活性升高及線粒體組分分布增加 通過GTPase活性檢測顯示,磷酸化Drp1相比對照組Drp1的GTPase活性顯著增加；而通過提純線粒體組分后蛋白印跡發(fā)現(xiàn)磷酸化后的Drp1大部分分布于線粒體組分中,而去磷酸化的Drp1更多的分布于胞漿中；此外,二聚化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明Drp1的磷酸化對于其二聚化的形成并沒有影響。 6.Drp1磷酸化會導(dǎo)致線粒體過度分裂并降低ATP的產(chǎn)生和樹突脊的形成 形態(tài)分析實(shí)驗(yàn)證明Drp1磷酸化會導(dǎo)致線粒體過度分裂。進(jìn)一步的生化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明Drp1磷酸化會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量降低,并影響神經(jīng)元突觸的形成。 7. Tat-Drp1DD阻斷GSK3β與Drp1的結(jié)合并檢測其效率 在之前工作的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)多肽Tat-Drp1DD干擾GSK3β與Drp1的結(jié)合,并檢測藥物處理后的Drp1磷酸化；此外,多肽處理神經(jīng)元之后可觀察到線粒體形態(tài)有一定程度的恢復(fù)。 8.海馬腦區(qū)注射Tat-Drp1DD可改善AD小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力 實(shí)驗(yàn)選取12個(gè)月左右已顯現(xiàn)癡呆癥狀的AD小鼠為研究對象,在AD小鼠腦內(nèi)注射多肽14天后,處死并取海馬腦區(qū)做蛋白印跡分析,結(jié)果顯示藥物處理后海馬腦區(qū)的Drp1磷酸化水平顯著降低。同時(shí),小鼠腦內(nèi)caspase3活性下降,突觸蛋白synaptophysin表達(dá)量回升。此外,免疫組化結(jié)果顯示小鼠腦內(nèi)的amyloid β沉積明顯下降。 9. Tat-Drp1DD可降低AD小鼠海馬腦區(qū)的Drp1磷酸化水平 在行為學(xué)檢測中,實(shí)驗(yàn)組用Tat-Drp1DD進(jìn)行海馬腦區(qū)注射,隨后的新奇物體認(rèn)知及水迷宮的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力顯著上升。 結(jié)論： 通過分子細(xì)胞水平到動物行為學(xué)水平的一系列實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)GSK3β通過磷酸化Drp1上40位及44位的絲氨酸誘導(dǎo)線粒體的分裂,并對其具體的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。同時(shí),在AD小鼠中,設(shè)計(jì)多肽干擾GSK3β與Drp1的結(jié)合可以有效的降低Drp1的磷酸化,并改善癡呆小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
【關(guān)鍵詞】：GSK3β Drp1 線粒體 阿茲海默綜合癥 學(xué)習(xí)與記憶
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 符號說明12-13
• 前沿13-15
• 實(shí)驗(yàn)材料15-23
• 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-37
• 討論37-40
• 附圖40-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 致謝50-51
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄51-52
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表52

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 Dragos Cīrneci;Radu Silaghi-Dumitrescu;;Learning tasks as a possible treatment for DNA lesions induced by oxidative stress in hippocampal neurons[J];Neural Regeneration Research;2013年32期

2 許美芬;何軼群;管敏鑫;;線粒體融合、分裂與神經(jīng)變性疾病[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年12期

3 王雨o，

本文編號：741098