本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)源性白細(xì)胞介素-6的分泌機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Toll樣受體2信號通路對IL-6分泌的影響 目的利用特異性的激動劑、阻斷劑以及siRNA，探討MSC中TLR2、NFκB對IL-6分泌的影響，揭示MSC內(nèi)源性IL-6分泌的可能信號通路，并通過MSC與OGD損傷PC12細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，初步探討MSC內(nèi)源性分泌IL-6的可能生物學(xué)功能。 方法在本課題組前期研究工作基礎(chǔ)上，以EBSS無糖培養(yǎng)基替換PC12常規(guī)培養(yǎng)基，在5%O2、95%N2和5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4h，建立OGD損傷PC12細(xì)胞模型，損傷后與MSC混合共培養(yǎng)24h，同時以單獨OGD損傷PC12為損傷對照組，以正常PC12細(xì)胞共培養(yǎng)為共培養(yǎng)對照組，western blotting方法檢測凋亡因子Bax的表達(dá)變化，ELISA試劑盒檢測不同處理組中IL-6的分泌水平變化。TLR2激動劑PGN-SA8ug/ml處理MSC24h、腺病毒Ad-siTLR2干預(yù)MSC24h和48h，或NFκB阻斷劑PDTC處理MSC24h后，分別用real-time PCR和/或western blotting檢測不同干預(yù)條件下MSC中TLR2、NFκB和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果（1）經(jīng)western blotting檢測，OGD損傷的PC12細(xì)胞與MSC混合共培養(yǎng)組中凋亡因子Bax的表達(dá)水平顯著低于PC12OGD損傷組及PC12細(xì)胞自身共培養(yǎng)組（P0.05，P0.01）。（2）ELISA方法檢測顯示OGD損傷的PC12細(xì)胞與MSC混合共培養(yǎng)組中IL-6的分泌水平顯著高于PC12OGD損傷組及PC12細(xì)胞自身共培養(yǎng)組（P0.001）。（3）real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGN-SA及Ad-siTLR2均可特異性激動或抑制TLR2的mRNA表達(dá)水平（P0.01，P0.001），與未處理組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.01，P0.001）；同時隨著TLR2mRNA表達(dá)水平的變化，細(xì)胞中的NFκB和IL-6mRNA表達(dá)水平也會呈現(xiàn)相應(yīng)的增高或降低。（4）western blotting檢測結(jié)果顯示，PGN-SA可特異性上調(diào)MSC中TLR2的蛋白表達(dá)水平（P0.01），并引起NFκB和IL-6的蛋白表達(dá)水平增高，經(jīng)灰度值統(tǒng)計學(xué)分析，與未處理組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）； Ad-siTLR2特異性抑制MSC中TLR2的蛋白表達(dá)水平（P0.01），同時導(dǎo)致NFκB和IL-6的蛋白表達(dá)水平降低，經(jīng)灰度值統(tǒng)計學(xué)分析，與RFP組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01，P0.001）；NFκB的阻斷劑在特異性下調(diào)MSC中NFκB蛋白表達(dá)水平的同時（P0.01），繼而導(dǎo)致IL-6的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P0.05），但對TLR2的表達(dá)無明顯影響（P0.05）。 結(jié)論（1）MSC共培養(yǎng)可降低OGD損傷PC12細(xì)胞中凋亡基因Bax的表達(dá)水平，提示MSC對損傷的PC12細(xì)胞具有修復(fù)作用，這種修復(fù)作用可能與MSC內(nèi)源性IL-6的高分泌有關(guān)。（2）PGN-SA或Ad-siTLR2可特異性改變TLR2的表達(dá)水平，，同樣也可引起NFκB和IL-6表達(dá)水平的相應(yīng)變化。（3）PDTC可有效抑制MSC中NFκB和IL-6的表達(dá)水平，但對TLR2的表達(dá)無顯著作用，提示MSC分泌IL-6是通過TLR2/NFκB信號通路而實現(xiàn)的。 第二部分白細(xì)胞介素-6對Toll樣受體2信號通路及其神經(jīng)修復(fù)的影響 目的篩選siIL-6-MSC穩(wěn)定細(xì)胞株，并用腺病毒Ad-IL-6干預(yù)MSC探討MSC內(nèi)源性IL-6分泌對TLR2/NFκB信號通路的調(diào)控，闡明MSC分泌IL-6的分子機(jī)制，并揭示MSC對損傷PC12細(xì)胞可能的修復(fù)功能。 方法腺病毒Ad-IL-6瞬時干預(yù)MSC24h或48h后,利用real-timePCR或western blotting檢測干預(yù)后MSC中TLR2、NFκB和IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平變化。采用siIL-6慢病毒感染MSC，通過5ug/ml的puromycin進(jìn)行加壓篩選，獲得siIL-6穩(wěn)定表達(dá)的MSC細(xì)胞株并鑒定。將所獲得的siIL-6-MSC細(xì)胞與OGD損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)24h,同時以GFP-MSC為共培養(yǎng)對照組，western blotting檢測凋亡基因Bax的表達(dá)變化，全細(xì)胞膜片鉗檢測共培養(yǎng)組中PC12細(xì)胞的靜息膜電位變化情況。 結(jié)果（1）腺病毒Ad-IL-6感染MSC后可明顯上調(diào)IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平（P0.01，P0.001），但并不影響TLR2和NFκB的表達(dá)。（2）經(jīng)puromycin篩選后獲得的siIL-6-MSC穩(wěn)定細(xì)胞株，在倒置熒光顯微鏡下可見較強(qiáng)綠色熒光，感染率約85%以上，進(jìn)一步檢測siIL-6-MSC穩(wěn)定細(xì)胞株中IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著性的降低（P0.05，P0.001），但該細(xì)胞中的TLR2和NFκB的表達(dá)水平并沒有顯著性的變化。（3）OGD損傷PC12細(xì)胞與siIL-6-MSC共培養(yǎng)后，其凋亡因子Bax的表達(dá)水平明顯高于GFP-MSC對照組（P0.01）；全細(xì)胞膜片鉗檢測與siIL-6-MSC共培養(yǎng)后的OGD損傷PC12細(xì)胞膜靜息電位與閾電位差值明顯高于對照組。表明IL-6表達(dá)水平降低時，MSC對OGD損傷PC12細(xì)胞的促修復(fù)作用下降。 結(jié)論（1）成功篩選出siIL-6穩(wěn)定表達(dá)的MSC細(xì)胞株。（2）IL-6表達(dá)水平的增高或降低并不影響MSC中TLR2和NFκB的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗證MSC內(nèi)源性IL-6的分泌是通過TLR2/NFκB信號通路而實現(xiàn)的，且IL-6的分泌對MSC中TLR2/NFκB信號通路沒有反饋性調(diào)節(jié)作用。（3）IL-6表達(dá)下降時，MSC對損傷PC12細(xì)胞的促修復(fù)作用降低，提示MSC內(nèi)源性的IL-6可能在促進(jìn)損傷神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡和神經(jīng)活性恢復(fù)中發(fā)揮生物學(xué)功能。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體2 PGN-SA Ad-siTLR2 PDTC 白細(xì)胞介素-6 NFκB Ad-IL-6 siIL-6 MSC 白細(xì)胞介素-6 抗凋亡 靜息膜電位
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-16
• 前言16-19
• 第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Toll樣受體2信號通路對白細(xì)胞介素-6分泌的影響19-39
• 1 材料與方法19-29
• 2 結(jié)果29-36
• 3 討論36-38
• 小結(jié)38-39
• 第二部分 白細(xì)胞介素-6 對 Toll 樣受體 2 信號通路及其神經(jīng)修復(fù)的影響39-52
• 1 材料與方法39-42
• 2 結(jié)果42-49
• 3 討論49-51
• 小結(jié)51-52
• 全文總結(jié)52-53
• 文獻(xiàn)綜述53-66
• 全文參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉晶晶;張峗;畢楊;龔敏;李廷玉;陳潔;;大鼠白細(xì)胞介素-6重組腺病毒構(gòu)建及初步鑒定[J];免疫學(xué)雜志;2014年02期

本文編號：739130