本文關(guān)鍵詞：發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）感染中宿主相關(guān)miRNA表達(dá)譜研究

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【摘要】：目的 發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)是近年來我國新發(fā)現(xiàn)布尼亞病毒科白蛉病毒屬的病毒,迫切需要闡明SFTSV的感染機(jī)制和致病機(jī)理,這對于制定有效的預(yù)防和治療措施具有重要意義,但目前在這方面的研究尚缺乏。本研究從發(fā)熱伴血小板減少綜合征病人的血清樣本中獲得miRNA的表達(dá)譜,并建立THP-1細(xì)胞感染模型初步探尋表達(dá)差異的miRNA與SFTS病毒感染的關(guān)聯(lián)性,有助深入理解及研究SFTS病毒感染的致病機(jī)理、疾病進(jìn)程以及免疫功能等,可為臨床防制、新型抗病毒治療方式的開發(fā)提供參考。方法1)鑒定感染患者血清microRNAs的差異表達(dá),通過TaqMan低密度芯片(TLDA)獲得血清miRNA的表達(dá)譜,用定量RT-PCR(qRT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證,分析和鑒定病毒感染和宿主免疫應(yīng)答的相關(guān)miRNAs。 2)建立THP-1細(xì)胞SFTSV體外感染模型,分析表達(dá)顯著改變的miRNAs以及mRNAs表達(dá)水平,并結(jié)合生物信息學(xué),預(yù)測差異表達(dá)miRNA的功能,試圖從病毒蛋白作用、宿主與病毒相互作用、宿主自身狀態(tài)等角度探究病毒感染發(fā)病機(jī)制。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行miRNA表達(dá)的驗(yàn)證,以進(jìn)一步確認(rèn)與病毒感染相關(guān)的microRNA。結(jié)果1)分析血清TLDA芯片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)與正常人血清相比,SFTS血清表達(dá)上調(diào)超過2倍的miRNA有117個(gè),表達(dá)下調(diào)超過2倍的miRNA有30個(gè)。其中,變化倍數(shù)在2-4之間的有22個(gè),變化倍數(shù)在4-10之間的有25個(gè),10-40倍之間的有27個(gè),40-200倍之間的有14個(gè),超過300倍的有32個(gè)。對表達(dá)差異較為明顯的miRNA進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)22個(gè)與病毒感染或免疫功能相關(guān)的miRNA,其中上調(diào)的有20個(gè),下調(diào)的有2個(gè)。使用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了我們在TLDA芯片表達(dá)譜差異表達(dá)miRNA中選出的22種候選miRNA的表達(dá)量。經(jīng)過定量RT-PCR驗(yàn)證,顯示顯著變化的9種表達(dá)差異miRNA (miR-146a、miR-15b、miR-24、miR-628-5p、 miR-101、miR-126、miR-155. miR-221、miR-34a)。2)借助于AffymetrixmiRNA芯片,以THP-1細(xì)胞作為SFTSV體外感染模型,分析表達(dá)顯著改變的miRNA以及mRNA表達(dá)水平,在最終548個(gè)靶基因中發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異表達(dá)miRNA具有調(diào)控的靶基因,上調(diào)miRNA13個(gè),hsa-miR-149,, hsa-miR-155, hsa-miR-1915, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-221, hsa-miR-193b, hsa-miR-146a, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-132, hsa-miR-1908, hsa-miR-638, hsa-miR-1469:下調(diào)miRNA3個(gè),hsa-miR-1307, hsa-miR-345, hsa-miR-320a。靶標(biāo)TOLL信號通路中重要調(diào)控因子(如TNF、CAT、IL1B、STAT1、 CCL5、MAP3K11、CD81、LITAF、CARD9)及對抗藥物反應(yīng)因子SLC1A3、CENPF。并且在THP-1細(xì)胞水平中采用qRT-PCR驗(yàn)證了miR-146a、miR-155的差異表達(dá)。采用MAS3.0軟件對上/下調(diào)miRNA調(diào)控的靶基因分別進(jìn)行GO/KEGG功能注釋分析。上調(diào)與下調(diào)miRNA調(diào)控的靶基因KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn),這些基因參與調(diào)控的信號途徑有抗原加工、宿主對抗、細(xì)胞因子相互作用、信號傳導(dǎo)等。結(jié)果提示差異表達(dá)的miRNA可能與SFTSV感染相關(guān)的主要信號通路的重要基因相關(guān)。結(jié)論本研究從血清與細(xì)胞水平,分析與SFTSV感染相關(guān)差異表達(dá)miRNA,首次從miRNA角度初步探尋SFTS病毒感染的分子致病和免疫機(jī)理,并為研發(fā)有效疾病防控與治療措施提供參考。
【關(guān)鍵詞】：發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒 血清 microRNAs 低密度芯片 細(xì)胞miRNA和mRNA表達(dá)譜 靶基因 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSRTACT6-12
• 縮略詞表12-13
• 第一章 研究背景綜述13-31
• 1.1 發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒研究進(jìn)展13-19
• 1.1.1 疾病的發(fā)現(xiàn)13-14
• 1.1.2 SFTS的臨床表現(xiàn)與診斷14-15
• 1.1.3 SFTS的傳播途徑15
• 1.1.4 SFTSV的致病機(jī)理研究進(jìn)展15-19
• 1.2 miRNA相關(guān)研究進(jìn)展19-24
• 1.2.1 miRNA概述19-20
• 1.2.2 miRNA的結(jié)構(gòu)與加工成熟過程20-21
• 1.2.3 miRNA作用機(jī)制21-24
• 1.3 生物信息學(xué)與miRNA功能研究24-25
• 1.4 研究目的25-26
• 參考文獻(xiàn)26-31
• 第二章 發(fā)熱伴血小板綜合征患者血清miRNA表達(dá)譜研究31-53
• 2.1 研究技術(shù)路線32
• 2.2 SFTSV血清miRNA表達(dá)譜鑒定32-37
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料32-34
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 2.3 SFTSV血清miRNA表達(dá)譜qRT-PCR驗(yàn)證37-40
• 2.3.1 研究對象37
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-48
• 2.4.1 TLDA芯片miRNA表達(dá)譜分析40
• 2.4.2 病毒感染和宿主免疫相關(guān)miRNA分析40-46
• 2.4.4 差異表達(dá)qRT-PCR驗(yàn)證46-48
• 2.5 討論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 第三章 發(fā)熱伴血小板綜合征病毒感染細(xì)胞水平miRNA篩選及預(yù)測功能分析53-85
• 3.1 SFTSV感染細(xì)胞54-58
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法55-58
• 3.2 SFTSV感染THP-1細(xì)胞miRNA表達(dá)譜鑒定58-64
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法59-64
• 3.3 miRNA表達(dá)譜檢測64-66
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)材料64
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)方法64-66
• 3.4 SFTSV感染THP-1細(xì)胞miRNA qRT-PCR驗(yàn)證66
• 3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-80
• 3.5.1 ELISA法檢測不同稀釋度病毒感染后NP蛋白表達(dá)結(jié)果66-67
• 3.5.2 間接免疫熒光法檢測NP蛋白表達(dá)情況67-68
• 3.5.3 S基因拷貝數(shù)68-69
• 3.5.4 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果69-70
• 3.5.5 miRNA芯片檢測結(jié)果70
• 3.5.6 mRNA芯片檢測結(jié)果70-71
• 3.5.7 miRNA篩選及預(yù)測功能分析71-76
• 3.5.8 miRNA介導(dǎo)的靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建76-79
• 3.5.9 SFTSV感染THP-1細(xì)胞miRNA qRT-PCR驗(yàn)證79-80
• 3.6 討論80-82
• 參考文獻(xiàn)82-85
• (附) 第四章 歐洲類禽豬流感病毒分離及生物信息學(xué)分析85-105
• 4.1 材料與方法86-90
• 4.1.1 病毒分離與鑒定86-87
• 4.1.2 病毒RNA提取和RT-PCR87-88
• 4.1.3 RT-PCR產(chǎn)物克隆88-89
• 4.1.4 全基因組完整編碼序列測定及分析89-90
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-102
• 4.2.1 病毒分離鑒定90-91
• 4.2.2 病毒基因序列測定91
• 4.2.3 同源性比較91-93
• 4.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析93-94
• 4.2.5 核苷酸及氨基酸分析94-102
• 4.3 討論102-103
• 參考文獻(xiàn)103-105
• 在讀期間學(xué)術(shù)成果105-106
• 致謝106-107

【共引文獻(xiàn)】

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9 方正;自主跑輪運(yùn)動與熱量限制對小鼠骨骼肌自噬相關(guān)的microRNA表達(dá)的影響[D];華東師范大學(xué);2014年

10 徐威;聯(lián)合轉(zhuǎn)染Livin和Survivin shRNA表達(dá)載體對肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];山東大學(xué);2014年

本文編號：733868