本文關(guān)鍵詞：朊病毒感染后葡萄糖轉(zhuǎn)運體與葡萄糖攝取能力的變化及其機制初探

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【摘要】：朊病毒病是一類慢性神經(jīng)退行性疾病，也稱為可傳播性海綿狀腦病（Transmissible spongiform encephalopathies，TSEs）。這類疾病的共同的病理特點是：進行性腦組織空泡樣變（即腦組織海綿狀變性）、神經(jīng)元丟失、淀粉樣斑塊形成和星形膠質(zhì)細胞增生等。目前已在人類和其他哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)了多種朊病毒病，并可由動物傳染至人類，動物之間也存在著跨種屬傳播。研究認為，朊病毒病的病原體是由細胞內(nèi)正常朊蛋白（PrPC）錯誤折疊而來的異常的朊蛋白（PrPSc）。不同的錯誤折疊形式會導(dǎo)致與不同朊病毒毒株相關(guān)的PrPSc產(chǎn)生，而不同朊病毒毒株的感染又會導(dǎo)致具有不同潛伏期、不同PrPSc的聚集形式以及不同程度腦組織局部病變等不同臨床表型的朊病毒病的發(fā)生。 葡萄糖是哺乳動物體內(nèi)主要的供能物質(zhì)，更是腦組織中的關(guān)鍵供能物質(zhì)。哺乳動物絕大多數(shù)體細胞是通過經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運體（Glucose transporters, GLUTs）易化的形式來攝取葡萄糖的。GLUTs有多種異構(gòu)體，它們的分布均具有組織和細胞的特異性。其中腦組織中兩個最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體是葡萄糖轉(zhuǎn)運體1（Glucose transporter1，GLUT1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運體3(Glucose transporter3，GLUT3)，它們均屬于可溶性載體家族2(Solute carrier family，SLC2)。其中GLUT1主要分布在血腦屏障內(nèi)皮細胞及星型膠質(zhì)細胞上，負責將血液循環(huán)中的葡萄糖轉(zhuǎn)運到腦組織及星型膠質(zhì)細胞中；GLUT3負責神經(jīng)元的葡萄糖攝取，，是神經(jīng)元中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體。已有研究發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默病（Alzheimer disease,AD）、亨廷頓舞蹈�。℉untington’s disease,HD）患者腦組織中GLUT1及GLUT3表達量下降，且這種現(xiàn)象發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)之前。另外，一些研究還表明，AD患者腦組織中GLUT1與GLUT3的下降與轉(zhuǎn)錄因子HIF1-α的下調(diào)有關(guān)，而HD患者腦組織中伴隨著GLUT1、GLUT3的下降還有葡萄糖代謝率的降低和葡萄糖攝取能力的減弱。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，在散發(fā)性克雅氏病（sporadic Creutzfeldt-Jacob disease，sCJD）病人腦組織中大腦皮層的廣泛區(qū)域葡萄糖代謝率減低,但其相關(guān)機制尚無研究報道。本研究擬探究朊病毒感染后GLUT1和GLUT3蛋白水平和葡萄糖攝取活性的變化及其可能的機制，以期在更深的層次上從能量代謝的角度去認識朊病毒病。 目的： 檢測朊病毒病動物模型（263K或139A感染的倉鼠及139A或ME7感染的小鼠）腦組織及朊病毒感染的細胞模型SMB-S15細胞系中GLUT1和GLUT3蛋白表達情況的變化，并利用2-[氮-7-硝基苯-2-乙二酸，3,4-羥氨基）]-2-脫氧葡萄糖{2-[N-(7-nitrobenze-2-oxa-1,3diazol-4-yl) amino]-2deoxy-glucose,2-NDBG}檢測SMB-S15細胞葡萄糖攝取能力的變化。另外，檢測朊病毒感染動物模型腦組織中轉(zhuǎn)錄因子HIF1-α（hypoxia inducible factor-1alpha）的蛋白水平，以初步探究可能的相關(guān)機制。 方法： 1、分別以正常、263K或139A感染的倉鼠及正常、139A或ME7感染的小鼠腦組織制備腦組織勻漿，并以Western Blot的方法分別檢測其中GLUT1、GLUT3的蛋白表達水平； 2、進行GLUT3分別與神經(jīng)元特異性核蛋白（Neuron-specific Nuclear Protein，NeuN）或膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的免疫熒光雙標染色，分別了解它們的共定位情況； 3、分別以正常、263K或139A感染的倉鼠及正常、139A或ME7感染的小鼠腦組織制備腦組織石蠟切片，先后用免疫組織化學染色法（Immunohistochemical,IHC）、免疫熒光檢測法（Immunofluorescent assay,IFA）檢測腦組織切片中GLUT3蛋白的表達情況； 4、用Western Blot和免疫細胞化學（Immunocytochemistry,ICC）的方法分別檢測SMB-S15和SMB-PS細胞系中GLUT1或GLUT3的蛋白表達情況； 5、用2-NDBG分別檢測SMB-S15和SMB-PS細胞的葡萄糖攝取能力； 6、用Western Blot的方法檢測朊病毒感染的動物模型腦組織勻漿中轉(zhuǎn)錄因子HIF1-α蛋白表達水平的變化。 結(jié)果： 1、與年齡、性別匹配的正常對照組相比，不同朊病毒毒株（263K、139A或ME7）感染的嚙齒動物模型腦組織勻漿中GLUT3蛋白表達量均明顯降低（P0.05），而GLUT1蛋白表達量的變化無統(tǒng)計學差異（P0.05）； 2、GLUT3與NeuN有著良好的共定位狀態(tài)，但與GFAP卻沒有共定位現(xiàn)象； 3、與年齡、性別匹配的正常對照組相比，朊病毒毒株263K、139A或ME7感染的嚙齒動物模型腦組織切片中大腦皮質(zhì)錐體細胞層和小腦浦肯野細胞層GLUT3染色陽性細胞數(shù)均有所減少，且陽性細胞中GLUT3蛋白信號均明顯減弱（P0.05）。且IFA顯示GLUT3陽性信號主要分布在細胞漿中，其次在胞膜上； 4、Western Blot與ICC結(jié)果均顯示：與PS細胞系相比，S15細胞系中GLUT3蛋白的信號明顯減弱（P0.05）,而GLUT1蛋白的信號變化無統(tǒng)計學差異（P0.05）； 5、用2-NDBG檢測SMB-S15細胞和SMB-PS細胞的葡萄糖攝取功能試驗結(jié)果顯示：與PS細胞相比，S15細胞中2-NDBG的綠色熒光信號明顯較弱（P0.05）： 6、與年齡、性別匹配的正常對照組相比，朊病毒感染的動物模型腦組織勻漿中HIF1-α蛋白信號明顯減弱（P0.05），且隨著感染時間延長而不斷減弱（P0.001）。 結(jié)論： 1、朊病毒感染后腦組織、細胞中GLUT3蛋白水平明顯下調(diào)，而GLUT1蛋白水平無明顯變化； 2、腦組織中GLUT3主要表達于神經(jīng)元中，星形膠質(zhì)細胞中不表達； 3、朊病毒感染的動物模型腦組織中存在著神經(jīng)元的丟失，存活神經(jīng)元中GLUT3蛋白表達水平下調(diào)。且GLUT3蛋白主要位于神經(jīng)元胞漿中，其次位于細胞膜上； 4、朊病毒持續(xù)性感染的SMB-S15細胞系的葡萄糖攝取活性下降，這可能由感染后GLUT3的蛋白表達量下調(diào)所致； 5、朊病毒感染導(dǎo)致的GLUT3表達下調(diào)和葡萄糖攝取活性的下降可能由HIF1-α蛋白水平的下調(diào)引起。
【關(guān)鍵詞】：朊病毒 羊瘙癢因子 神經(jīng)元 葡萄糖轉(zhuǎn)運體1 葡萄糖轉(zhuǎn)運體3 2-NDBG 低氧誘導(dǎo)因子1α
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-26
• 1 朊病毒病和朊病毒18-22
• 1.1 朊病毒病18-19
• 1.2 朊病毒19-22
• 1.2.1 朊病毒學說19-20
• 1.2.2 朊病毒毒株20-21
• 1.2.3 朊病毒持續(xù)性感染的細胞系21-22
• 2 葡萄糖轉(zhuǎn)運體和神經(jīng)退行性疾病22-26
• 2.1 葡萄糖是腦組織中的關(guān)鍵功能物質(zhì)22-23
• 2.2 葡萄糖轉(zhuǎn)運體23-24
• 2.3 神經(jīng)退行性疾病與葡萄糖轉(zhuǎn)運體表達24-26
• 1 材料26-31
• 1.1 實驗標本26-27
• 1.2 主要化學試劑及耗材27-28
• 1.3 分子量標準及試劑盒28
• 1.4 主要儀器及設(shè)備28-29
• 1.5 常用緩沖液及溶液29-31
• 2 方法31-37
• 2.1 羊瘙癢因子感染的嚙齒類動物腦組織樣品的制備31-32
• 2.2 Western Blot32-33
• 2.3 組織切片的免疫熒光染色33-34
• 2.4 石蠟切片的免疫組織化學染色34
• 2.5 細胞的復(fù)蘇、傳代及凍存34-35
• 2.6 制備細胞裂解物35
• 2.7 BCA 法檢測蛋白濃度35-36
• 2.8 免疫細胞化學染色36
• 2.9 葡萄糖攝取活性的檢測36-37
• 2.10 統(tǒng)計分析及處理37
• 3 結(jié)果37-49
• 3.1 朊病毒感染終末期嚙齒動物模型腦組織勻漿中 GLUT3 的蛋白水平明顯降低37-38
• 3.2 朊病毒感染終末期嚙齒動物模型腦組織勻漿中 GLUT1 蛋白水平的變化無統(tǒng)計學差異38-39
• 3.3 263K 感染的倉鼠腦組織勻漿中 GLUT3 的蛋白水平隨著感染時間的延長而不斷下降39-40
• 3.4 GLUT3 與 NeuN 有著良好的共定位狀態(tài),但與 GFAP 無共定位現(xiàn)象40-41
• 3.5 不同毒株感染終末期嚙齒動物模型腦組織切片中大腦皮質(zhì)及小腦中 GLUT3 陽性細胞數(shù)減少,且陽性細胞中的 GLUT3 信號較正常對照組中的減弱41-43
• 3.6 不同朊病毒毒株感染終末期嚙齒動物模型大腦皮質(zhì)及小腦神經(jīng)元中 GLUT3 蛋白主要位于神經(jīng)元胞漿中43-45
• 3.7 S15 細胞系中 GLUT3 蛋白表達量較 PS 細胞中下降而 GLUT1 的表達量無明顯變化45-47
• 3.8 葡萄糖攝取活性的檢測發(fā)現(xiàn) S15 細胞中的 2-NDBG 信號較 PS 細胞中的明顯減弱47-48
• 3.9 朊病毒感染的動物模型腦組織勻漿中 HIF1-α的蛋白水平隨著感染時間的延長而不斷下降48-49
• 4 討論49-53
• 小結(jié)53-55
• 參考文獻55-65
• 個人簡歷和研究成果65-66
• 個人簡歷65
• 研究成果65-66
• 致謝66-67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Influence of blood glucose on the expression of glucose transporter proteins 1 and 3 in the brain of diabetic rats[J];Chinese Medical Journal;2007年19期

本文編號：729053