本文關鍵詞：間日瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25在家蠶桿狀病毒系統(tǒng)中的表達研究

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【摘要】：間日瘧(Vivax malaria)是由間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)引起的周期性發(fā)作的急性傳染病，特點是間隔48小時反復發(fā)作。如今已有的抗瘧疾藥物也由于抗藥性瘧原蟲以及耐殺蟲劑傳播蚊的出現(xiàn)而面臨挑戰(zhàn)。制備瘧疾疫苗也就成為了能有效控制瘧疾傳播的主要手段。其中傳播阻斷疫苗（transmission blocking vaccines，TBVs）是以蚊蟲階段瘧原蟲特異表達的蟲體表面蛋白作為抗原免疫人體，使之產(chǎn)生抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體。間日瘧傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25是瘧疾研究的主要靶點，，其在不同地區(qū)的瘧疾病毒株間具有很高的保守性。 Pvs25是在合子以及動合子表面表達的蛋白，分子量為25kDa，含有22個半胱氨酸形成的11個二硫鍵，序列含有4個類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(EGF-like Domain)。本課題通過構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-32a-Pvs25獲得工程菌，經(jīng)IPTG誘導后重組蛋白大量表達；從誘導菌體超聲破碎后的上清中提取重組蛋白，經(jīng)Ni親和層析純化后，獲得重組蛋白純度達到95%；將純化后的重組蛋白免疫Balb/c雌鼠制備多克隆抗體；純化后的抗體經(jīng)間接ELISA測定效價為1：12800。同時，利用家蠶生物反應器平臺的Bac-to-Bac系統(tǒng)成功獲得重組桿狀病毒vBm-Pvs25，感染家蠶細胞、家蠶五齡幼蟲，Western Blotting分析結(jié)果顯示，目的蛋白表達成功。構(gòu)建BmCMV-gp64-Pvs25，在載體的多角體啟動子前面串聯(lián)一個CMV啟動子序列，這樣表達的重組蛋白Pvs25不僅可以在BmNPV的表面展示，而且可以在哺乳動物體內(nèi)展示。獲得重組桿狀病毒vBmCMV-gp64-Pvs25，用于感染家蠶細胞，經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlotting分析、激光共聚焦觀察，發(fā)現(xiàn)目的蛋白成功表達并展示于質(zhì)膜表面。利用純化得到的vBmCMVgp64-Pvs25病毒粒子免疫Balb/c小鼠獲取抗血清，并對其免疫原性進行研究，結(jié)果表明其中和效價為1：25600，可以有效刺激機體產(chǎn)生免疫保護反應。本課題為間日瘧傳播阻斷疫苗的進一步研究奠定了基礎。
【關鍵詞】：傳播阻斷疫苗 候選抗原 Pvs25 桿狀病毒 表面展示技術 vBmCMV-gp64-Pvs25
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R531.3;R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 目錄7-12
• 縮略語12-13
• 第一部分 文獻綜述與實驗設計13-23
• 第一章 緒論14-21
• 第一節(jié) 瘧疾疫苗的概述14-17
• 1.1 紅前期疫苗15
• 1.2 紅內(nèi)期疫苗15-16
• 1.3 傳播阻斷疫苗16-17
• 1.4 展望17
• 第二節(jié) 間日瘧傳播阻斷疫苗 Pvs25 研究進展17-18
• 第三節(jié) 桿狀病毒研究進展18-21
• 3.1 家蠶核型多角體 BmNPV 表達載體系統(tǒng)18-19
• 3.2 家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)勢19
• 3.3 家蠶桿狀病毒表面展示技術19-21
• 第二章 實驗方案設計21-23
• 1 研究目的及意義21
• 2 研究內(nèi)容21-22
• 3 實驗流程圖22-23
• 第二部分 研究論文23-63
• 第一章 生物信息學分析24-29
• 1 生物信息學分析工具24
• 2 分析方法與結(jié)果24-29
• 2.1 Pvs25 基因序列24-25
• 2.2 CMV 的基因序列25
• 2.3 Pvs25 的疏水性分析25-26
• 2.4 Pvs25 的跨膜區(qū)預測26-27
• 2.5 Pvs25 的信號肽預測27
• 2.6 Pvs25 的二級結(jié)構(gòu)預測27
• 2.7 Pvs25 的高級結(jié)構(gòu)預測27-28
• 2.8 討論28-29
• 第二章 間日瘧傳播阻斷候選抗原 Pvs25 的原核表達29-41
• 1 材料和試劑29-32
• 1.1 材料和試劑29
• 1.2 試劑配制29-32
• 2 方法32-38
• 2.1 PCR 擴增目的片段32-33
• 2.2 PCR 產(chǎn)物與 pET-32a 載體的雙酶切33
• 2.3 酶切產(chǎn)物回收33
• 2.4 Pvs25 基因和 pET-32a 質(zhì)粒連接反應33-34
• 2.5 Rosetta 和 TG1 感受態(tài)細胞的制備34
• 2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化34
• 2.7 重組陽性克隆的鑒定34-35
• 2.8 重組菌的表達35-37
• 2.8.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化35
• 2.8.2 重組表達載體在大腸桿菌中的表達35
• 2.8.3 SDS-PAGE 電泳分析35
• 2.8.4 融合蛋白 Pvs25 的表達的 Western Blotting 鑒定35-36
• 2.8.5 融合蛋白 Pvs25 的大量表達和 Ni 柱純化36-37
• 2.8.6 目的蛋白定量和濃縮37
• 2.9 多克隆鼠抗的制備37-38
• 2.9.1 免疫動物37
• 2.9.2 多克隆抗血清的制備37
• 2.9.3 抗體純化37
• 2.9.4 抗體效價測定37-38
• 3 結(jié)果與分析38-40
• 3.1 Pvs25 基因的 PCR 擴增和表達載體 pET-32a-Pvs25 的構(gòu)建38-39
• 3.2 pET-32a-Pvs25 的原核表達鑒定39
• 3.3 pET-32a-Pvs25 的原核表達純化39-40
• 3.4 多克隆抗體的效價測定40
• 4 討論40-41
• 第三章 間日瘧傳播阻斷候選抗原 Pvs25 在家蠶桿狀病毒系統(tǒng)中的表達41-50
• 1 材料與試劑41-42
• 1.1 材料與試劑41
• 1.2 試劑配制41-42
• 2 方法42-46
• 2.1 重組質(zhì)粒 pFastBacHTB-Pvs25 的構(gòu)建42
• 2.1.1 Pvs25 片段的 PCR 擴增42
• 2.1.2 pFastBacHTB 和 Pvs25 片段的雙酶切42
• 2.1.3 連接反應42
• 2.2 重組病毒基因組 Bacmid-BmPvs25 的構(gòu)建42-44
• 2.2.1 DH10Bac 感受態(tài)的制備42
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化42-43
• 2.2.3 重組 Bacmid 的提取43
• 2.2.4 重組 Bacmid 的鑒定43-44
• 2.3 重組病毒 vBmPvs25 的構(gòu)建44-45
• 2.3.1 重組病毒基因組通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染家蠶 BmN 細胞44-45
• 2.3.2 重組病毒的 PCR 鑒定45
• 2.3.3 重組病毒的擴增以及病毒滴度測定45
• 2.4 重組蛋白 Pvs25 在家蠶 BmN 細胞中的表達和鑒定45-46
• 2.5 重組蛋白 Pvs25 在家蠶五齡幼蟲中的表達和鑒定46
• 2.5.1 重組病毒 vBmPvs25 感染家蠶五焌幼蟲46
• 2.5.2 Western Blotting 鑒定融合蛋白 Pvs25 的表達46
• 3 結(jié)果與分析46-49
• 3.1 重組質(zhì)粒 pFastBacHTB Pvs25 的構(gòu)建的鑒定46
• 3.2 重組病毒 vBmPvs25 的鑒定46-47
• 3.3 Western Blotting 鑒定 Pvs25 蛋白在家蠶細胞中的表達情況47-48
• 3.4 Western Blotting 鑒定 Pvs25 在家蠶幼蟲中的表達48-49
• 4 討論49-50
• 第四章 Pvs25 蛋白的桿狀病毒表面展示的研究50-63
• 1 材料與試劑50
• 1.1 材料與試劑50
• 2 方法50-55
• 2.1 引物設計與 Pvs25 基因的獲得50-51
• 2.2 重組質(zhì)粒 pFastBacDual-CMV-SP-TM 的獲得51
• 2.3 重組質(zhì)粒 pFastBacDual-CMV-SP-Pvs25-TM 的構(gòu)建51-52
• 2.4 重組病毒基因組 Bacmid-CMV-gp64-Pvs25 的構(gòu)建52-53
• 2.4.1 DH10Bac 菌感受態(tài)的制備52
• 2.4.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化52
• 2.4.3 重組 Bacmid 的提取52
• 2.4.4 重組 Bacmid PCR 鑒定52-53
• 2.5 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的構(gòu)建53-54
• 2.5.1 重組病毒基因組通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染家蠶 BmN 細胞53
• 2.5.2 重組病毒的基因組提取以及 PCR 鑒定53-54
• 2.5.3 重組病毒的擴增和重組病毒滴度測定54
• 2.6 目的蛋白 Pvs25 在家蠶 BmN 細胞中的表達和鑒定54
• 2.6.1 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 感染家蠶 BmN 細胞54
• 2.6.2 Western Blotting 鑒定蛋白表達54
• 2.7 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的大量擴增54
• 2.8 重組病毒粒子的純化54
• 2.9 免疫細胞方法檢測 vBmCMV-gp64-Pvs25 在家蠶細胞中的表達54-55
• 2.10 純化的重組病毒粒子免疫小鼠55
• 2.11 抗體的效價測定55
• 3 結(jié)果與分析55-61
• 3.1 重組質(zhì)粒 pFastBacDualCMV-gp64-SP-Pvs25-TM 的構(gòu)建55-57
• 3.1.1 PCR 擴增 Pvs25 完整的 ORF 序列結(jié)果55-56
• 3.1.2 重組供體質(zhì)粒 pFastBacDualCMV-gp64-SP-Pvs25-TM 的鑒定56-57
• 3.2 重組 Bacmid PCR 鑒定57
• 3.3 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的鑒定57-58
• 3.4 Western Blotting 鑒定 Pvs25 蛋白在家蠶細胞中的表達58-59
• 3.5 免疫細胞方法檢測 Pvs25 蛋白在家蠶細胞中的表達59-60
• 3.6 抗體的效價測定60-61
• 4 討論61-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-69
• 致謝69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Genetic Modification of Baculovirus Expression Vectors[J];Virologica Sinica;2012年02期

本文編號：719865