本文關鍵詞：PKC或PKA誘導Talin高化學計算磷酸化反向調控Calpain介導的蛋白裂解和細胞遷移

  更多相關文章： Talin 高化學計算磷酸化 calpain介導的酶切(蛋白裂解) 粘附斑解體 PKC或PKA

【摘要】：粘附斑是一個由180多種蛋白組成的蛋白復合物,向外能連接ECM,向內則與肌動蛋白細胞骨架以及潛在的細胞遷移信號級聯(lián)網(wǎng)絡進行連接。在粘附斑的轉換的過程中,Talin因為它的calpain酶切位點介導的蛋白裂解作用而對粘附斑解聚起至關重要的作用,但調控機制還未得到很好的闡明�，F(xiàn)在我們證明：由PKC或PKA誘導的talin頭部三個高化學計算磷酸化位點磷酸化反向調控Calpain介導的蛋白裂解和細胞遷移。定點突變封閉高化學計算磷酸化,導致對talinT144A+T150A的影響為：蘇氨酸磷酸化水平的下降和PKC活性的增強；而對talinS446A的影響為：絲氨酸磷酸化水平的下降和PKA活性的增強。talinT144A+T150A蛋白的表達刺激Calpain介導的蛋白裂解,因而刺激粘附斑解體和細胞遷移,而talinS446A蛋白表達則能完全抑制talin的calpain酶切,因而阻止粘附斑解體和細胞遷移。PKC通過MAPK級聯(lián)信號途徑激活ERK并最終激活calpain,而PKA則表現(xiàn)為：不能完全抑制ERK的激活,但對抵消calpain的酶切活性。這些結果證實和強調了PKC或PKA誘導位點特異的Talin高化學計算磷酸化調控Calpain介導的蛋白裂解和粘附斑解體,因此控制粘附斑穩(wěn)定性,細胞粘附并最后調控細胞遷移的巨大作用。本文的創(chuàng)新點有以下幾點：一是所用細胞系全是經(jīng)過BD FACSAriaIII流式細胞分選儀(在488nm波長下激發(fā))最終分揀得到的完全均一的EGFP陽性細胞群；二是第一次把calpain酶切的機制和高化學計算磷酸化機制結合在一起進行闡述；三是所得實驗結果不僅完全符合假設,而且能和MAPK信號途徑產(chǎn)生新的聯(lián)系,是基礎領域內新的突破性進展。
【關鍵詞】：Talin 高化學計算磷酸化 calpain介導的酶切(蛋白裂解) 粘附斑解體 PKC或PKA
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329;Q26
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1. 引言與文獻綜述9-22
• 1.1 細胞遷移、細胞粘附的形成與解體9-14
• 1.2 Talin蛋白14-17
• 1.3 Calpain 2的酶切17-19
• 1.4 重組PCR法誘導定點突變19-20
• 1.5 研究目的和意義20-22
• 2. 材料與方法22-51
• 2.1 材料22-32
• 2.1.1 儀器設備22-23
• 2.1.2 主要試劑和耗材23-25
• 2.1.3 動物細胞系與菌種25
• 2.1.4 常用溶液的配制方法25-32
• 2.2 方法與步驟32-51
• 2.2.1 Talin(頭部片段)定點突變及表達載體的構建32-39
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)39-40
• 2.2.3 蛋白的處理40-43
• 2.2.4 Western blotting技術43-46
• 2.2.6 非放射性檢測PKC或PKA的活性46-48
• 2.2.7 細胞遷移和細胞粘附實驗48-51
• 3. 結果與分析51-67
• 3.1 Calpain 2酶切效果檢測51-52
• 3.2 RNA干擾確認calpain 2的酶切功能52-53
• 3.3 蘇氨酸或絲氨酸的磷酸化抗體檢測53-55
• 3.4 PKC,PKA含量測定55-58
• 3.5 MAPK級聯(lián)途徑,ERK的激活58-59
• 3.6 免疫熒光雙定位驗證粘附斑的形成59-61
• 3.7 粘附斑實時觀察解體61-62
• 3.8 細胞群粘附水平直觀比較62-63
• 3.9 細胞群粘附水平定量比較63-64
• 3.10 Wound-healing(劃痕)assays和Transwell assays64-67
• 4. 討論67-71
• 4.1 粘附斑形成,解體與細胞遷移67-68
• 4.2 與MAPK級聯(lián)途徑建立聯(lián)系68-69
• 4.3 實驗中遇到的困難及解決辦法69-71
• 5. 結語71-73
• 參考文獻73-76
• 致謝76-77
• 攻讀學位期間科研成果77-78

【共引文獻】

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