本文關(guān)鍵詞：PKC或PKA誘導(dǎo)Talin高化學(xué)計算磷酸化反向調(diào)控Calpain介導(dǎo)的蛋白裂解和細(xì)胞遷移

  更多相關(guān)文章： Talin 高化學(xué)計算磷酸化 calpain介導(dǎo)的酶切(蛋白裂解) 粘附斑解體 PKC或PKA

【摘要】：粘附斑是一個由180多種蛋白組成的蛋白復(fù)合物,向外能連接ECM,向內(nèi)則與肌動蛋白細(xì)胞骨架以及潛在的細(xì)胞遷移信號級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行連接。在粘附斑的轉(zhuǎn)換的過程中,Talin因為它的calpain酶切位點介導(dǎo)的蛋白裂解作用而對粘附斑解聚起至關(guān)重要的作用,但調(diào)控機制還未得到很好的闡明。現(xiàn)在我們證明：由PKC或PKA誘導(dǎo)的talin頭部三個高化學(xué)計算磷酸化位點磷酸化反向調(diào)控Calpain介導(dǎo)的蛋白裂解和細(xì)胞遷移。定點突變封閉高化學(xué)計算磷酸化,導(dǎo)致對talinT144A+T150A的影響為：蘇氨酸磷酸化水平的下降和PKC活性的增強；而對talinS446A的影響為：絲氨酸磷酸化水平的下降和PKA活性的增強。talinT144A+T150A蛋白的表達(dá)刺激Calpain介導(dǎo)的蛋白裂解,因而刺激粘附斑解體和細(xì)胞遷移,而talinS446A蛋白表達(dá)則能完全抑制talin的calpain酶切,因而阻止粘附斑解體和細(xì)胞遷移。PKC通過MAPK級聯(lián)信號途徑激活ERK并最終激活calpain,而PKA則表現(xiàn)為：不能完全抑制ERK的激活,但對抵消calpain的酶切活性。這些結(jié)果證實和強調(diào)了PKC或PKA誘導(dǎo)位點特異的Talin高化學(xué)計算磷酸化調(diào)控Calpain介導(dǎo)的蛋白裂解和粘附斑解體,因此控制粘附斑穩(wěn)定性,細(xì)胞粘附并最后調(diào)控細(xì)胞遷移的巨大作用。本文的創(chuàng)新點有以下幾點：一是所用細(xì)胞系全是經(jīng)過BD FACSAriaIII流式細(xì)胞分選儀(在488nm波長下激發(fā))最終分揀得到的完全均一的EGFP陽性細(xì)胞群；二是第一次把calpain酶切的機制和高化學(xué)計算磷酸化機制結(jié)合在一起進(jìn)行闡述；三是所得實驗結(jié)果不僅完全符合假設(shè),而且能和MAPK信號途徑產(chǎn)生新的聯(lián)系,是基礎(chǔ)領(lǐng)域內(nèi)新的突破性進(jìn)展。
【關(guān)鍵詞】：Talin 高化學(xué)計算磷酸化 calpain介導(dǎo)的酶切(蛋白裂解) 粘附斑解體 PKC或PKA
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329;Q26
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1. 引言與文獻(xiàn)綜述9-22
• 1.1 細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附的形成與解體9-14
• 1.2 Talin蛋白14-17
• 1.3 Calpain 2的酶切17-19
• 1.4 重組PCR法誘導(dǎo)定點突變19-20
• 1.5 研究目的和意義20-22
• 2. 材料與方法22-51
• 2.1 材料22-32
• 2.1.1 儀器設(shè)備22-23
• 2.1.2 主要試劑和耗材23-25
• 2.1.3 動物細(xì)胞系與菌種25
• 2.1.4 常用溶液的配制方法25-32
• 2.2 方法與步驟32-51
• 2.2.1 Talin(頭部片段)定點突變及表達(dá)載體的構(gòu)建32-39
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)39-40
• 2.2.3 蛋白的處理40-43
• 2.2.4 Western blotting技術(shù)43-46
• 2.2.6 非放射性檢測PKC或PKA的活性46-48
• 2.2.7 細(xì)胞遷移和細(xì)胞粘附實驗48-51
• 3. 結(jié)果與分析51-67
• 3.1 Calpain 2酶切效果檢測51-52
• 3.2 RNA干擾確認(rèn)calpain 2的酶切功能52-53
• 3.3 蘇氨酸或絲氨酸的磷酸化抗體檢測53-55
• 3.4 PKC,PKA含量測定55-58
• 3.5 MAPK級聯(lián)途徑,ERK的激活58-59
• 3.6 免疫熒光雙定位驗證粘附斑的形成59-61
• 3.7 粘附斑實時觀察解體61-62
• 3.8 細(xì)胞群粘附水平直觀比較62-63
• 3.9 細(xì)胞群粘附水平定量比較63-64
• 3.10 Wound-healing(劃痕)assays和Transwell assays64-67
• 4. 討論67-71
• 4.1 粘附斑形成,解體與細(xì)胞遷移67-68
• 4.2 與MAPK級聯(lián)途徑建立聯(lián)系68-69
• 4.3 實驗中遇到的困難及解決辦法69-71
• 5. 結(jié)語71-73
• 參考文獻(xiàn)73-76
• 致謝76-77
• 攻讀學(xué)位期間科研成果77-78

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳叢梅,黃天華,吳德生,謝慶東,徐小虎;pEgr-P16重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在EC9706細(xì)胞中的輻射誘導(dǎo)表達(dá)[J];癌變.畸變.突變;2003年04期

2 阮燁,王曉云,謝慶東,黃天華;外源DNA轉(zhuǎn)染精子的實驗研究[J];癌變.畸變.突變;2004年03期

3 歐陽松應(yīng),徐壽水,沈文律,周傳香,李春艷,歐陽紅生;人PTEN基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在U_(251)細(xì)胞中的表達(dá)[J];癌變.畸變.突變;2004年04期

4 陳傳德,吳中亮,陳家X;乙酸鎳誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性分析[J];癌變.畸變.突變;2005年01期

5 熊小芳,黃天華,謝慶東,王曉梅,陳桂蘭;精子攜帶的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的復(fù)制與表達(dá)[J];癌變.畸變.突變;2005年03期

6 呂慧貞;張建朋;陳新;劉靜;張元湖;;一種改進(jìn)的鴨梨總RNA提取方法[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年05期

7 張秀華;王文鋒;;微衛(wèi)星DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術(shù)的探討[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年06期

8 張學(xué)民,王金生;堿裂解法提取質(zhì)粒DNA方法的改進(jìn)[J];安徽大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年04期

9 倪大虎,向太和,張盤娣,吳家道,楊劍波,賈士榮,余增亮;應(yīng)用低能離子束將抗菌肽ShivaA基因?qū)牖謴?fù)系明恢63的研究(簡報)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年04期

10 許曉風(fēng),郁鋒,楊啟銀,陳育如,彭榮淮,賀海生,王程輝;煙草工業(yè)下腳料綜合利用研究(I)——抗菌成分的提取與抑菌效果測定[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃家強;卜夏;李卓婭;龔非力;;人TNFα分泌型、跨膜型和跨膜穩(wěn)定型重組體的構(gòu)建表達(dá)及殺瘤效應(yīng)[A];生命科學(xué)與生物技術(shù)：中國科協(xié)第三屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];1998年

2 郭昱嵩;王中鐸;劉楚吾;陳志明;劉筠;;勒氏笛鯛(Lutjanus russellii)線粒體DNA全序列的測定與分析[A];中國海洋學(xué)會2007年學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2007年

3 樊繼德;孔慶國;張梅;于喜艷;;子房注射法獲得轉(zhuǎn)基因甜瓜植株[A];中國園藝學(xué)會第七屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2006年

4 李俊華;吳少庭;翁亞彪;甘燕;劉洪波;劉茂鈴;張仁利;高世同;黃達(dá)娜;耿藝介;;弓形蟲表面抗原SAG2基因體外擴增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表達(dá)[A];全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 李俊華;吳少庭;翁亞彪;甘燕;劉洪波;劉茂鈴;張仁利;高世同;黃達(dá)娜;耿藝介;;弓形蟲致密顆粒蛋白GRA4基因體外擴增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表達(dá)[A];全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

6 唐小江;馬爭;黃建勛;黃漢林;李來玉;牛僑;;正己烷引起紅細(xì)胞膜血影蛋白交聯(lián)的研究[A];中國環(huán)境誘變劑學(xué)會抗誘變劑和抗癌劑專業(yè)委員會第三次全國學(xué)術(shù)會議、中國毒理學(xué)會生化與分子毒理專業(yè)委員會第五屆學(xué)術(shù)交流會、貴州省環(huán)境誘變劑學(xué)會成立大會暨首屆學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2004年

7 嚴(yán)家彬;李新輝;吳淑勤;杜合軍;;鱖魚病毒核酸特異片段表達(dá)及高效價抗體制備[A];可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖——資源、環(huán)境、質(zhì)量——2003水產(chǎn)科技論壇論文集[C];2003年

8 趙曉瑜;柳偉強;李曉霞;;蚯蚓抗菌肽40kDa Fetidin基因的原核表達(dá)與復(fù)性[A];2007年全國生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)年會論文集[C];2007年

9 張核子;王保捷;丁酶;肖仰哲;巴穎;李劍平;李春梅;劉利民;賴躍;;短串聯(lián)重復(fù)位點FGA擴增片段長度多態(tài)性研究[A];第二次全國法醫(yī)物證學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];1998年

10 胡姣;譚曉風(fēng);張琳;龍洪旭;田曉明;;油茶種子胚乳總RNA提取方法研究及改良[A];第二屆中國林業(yè)學(xué)術(shù)大會——S9 木本糧油產(chǎn)業(yè)化論文集[C];2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 梁勇;白念珠菌高鐵還原酶基因表達(dá)調(diào)控及Aft2p轉(zhuǎn)錄因子的功能研究[D];南開大學(xué);2010年

2 于雙妮;胰腺癌差異表達(dá)microRNAs的鑒定及功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2008年

3 陳其華;前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥臨床觀察及其對間質(zhì)細(xì)胞作用的實驗研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 馬麗菊;云南宣威肺癌細(xì)胞系側(cè)群細(xì)胞特征分析[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

5 許雷;大青楊纖維素合酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2011年

6 朱偉;攝食抑制因子NUCB2/Nesfatin-1對機體胰島素敏感性的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

7 王金鵬;4α糖基轉(zhuǎn)移酶環(huán)化活性定向控制及其大環(huán)糊精產(chǎn)物的分離及應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2011年

8 程光平;巴馬~P唇渻生物學(xué)及遺傳學(xué)研究[D];中國海洋大學(xué);2011年

9 宋娜;西北太平洋兩種海洋魚類的分子系統(tǒng)地理學(xué)研究及分子標(biāo)記在褐牙鲆增殖放流中的應(yīng)用[D];中國海洋大學(xué);2011年

10 郭里;若干圖論問題的DNA計算機算法研究[D];湖南大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱曉娟;重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的構(gòu)建、表達(dá)、純化及初步鑒定[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

2 錢靜;攜帶Apoptin雙調(diào)控溶瘤腺病毒治療肝癌的研究[D];浙江理工大學(xué);2010年

3 辛寧;PDX-1真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2010年

4 陸玉成;AMF基因在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)及功能初步分析[D];鄭州大學(xué);2010年

5 呂文兵;杜氏鹽藻異養(yǎng)轉(zhuǎn)化藻株的鑒定及初步功能分析[D];鄭州大學(xué);2010年

6 李靜;父源性HLA-A基因與子癇前期相關(guān)性研究[D];鄭州大學(xué);2010年

7 張燕松;腎移植術(shù)后患者PBMCs中NF-κB的活性和TNF-α mRNA的表達(dá)研究[D];鄭州大學(xué);2010年

8 張磊;杜氏鹽藻（Dunaliella salina）GPI多克隆抗體的制備及其在MDCK細(xì)胞中的定位[D];鄭州大學(xué);2010年

9 馮玖玲;杜氏鹽藻RbcS基因家族新成員的克隆及功能研究[D];鄭州大學(xué);2010年

10 陳操;日本七鰓鰻抗增殖蛋白Prohibitin1研究及類B淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)初探[D];遼寧師范大學(xué);2010年

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本文編號：719289