本文關鍵詞：人胚胎干細胞自我更新過程中調(diào)控性非編碼RNA的篩選及機制研究

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【摘要】：【研究背景與目的】 胚胎干細胞（ESC）是分離自囊胚內(nèi)細胞團的一種多能干細胞。對于多能性的定義可以從其分化能力進行分類，處于最頂端的是諸如受精卵等能夠分化為一個單獨個體的能力，我們常稱這種細胞為全能性干細胞；其次，具有能夠分化為多種組織細胞能力的干細胞我們稱之為多能性干細胞，而這其中ESC具有分化為任意組織細胞的能力，是所有多能性干細胞中“干性”最強的一種干細胞；而具有分化為特定組織的干細胞則常稱之為前體或祖細胞。我們所研究的人ESC作為一種在多能性上僅次于全能干細胞的細胞，其能夠在不喪失自身多能性的同時在體外環(huán)境下無限擴增，以及在特定誘導下形成各種組織細胞的特性使其成為用于生物發(fā)育研究、藥物篩選、組織修復的最理想細胞來源。然而目前對于胚胎干細胞的多能性是通過何種機制維持的，以及基于何種機制調(diào)控其分化為各個組織細胞的具體機理尚不明確，致使其應用受到一定程度的局限。 ESC的多能性是受到嚴格調(diào)控的。早期研究的內(nèi)容主要集中在信號通路對hESC的作用上，從中發(fā)現(xiàn)了Nodal/Activin以及BMP等信號通路對自我更新及多能性的影響。在對多種干性維持信號通路下進行深入探索后，發(fā)現(xiàn)下游的近乎所有多能性相關基因都受到轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2和Nanog的調(diào)控，因此人們將這三個因子稱之為多能性核心轉(zhuǎn)錄因子。而在山中伸彌（Shinya Yamanaka）通過將四個多能性轉(zhuǎn)錄因子導入成體細胞并使之成功轉(zhuǎn)變?yōu)镋SC樣的細胞后，更是引發(fā)了人們對于研究ESC干性調(diào)控網(wǎng)絡的濃厚興趣。其中非編碼RNA的相關研究在近幾年來得到相當大的重視。 非編碼RNA（ncRNA）曾被認為是細胞內(nèi)多余的成分，是RNA聚合酶II的副產(chǎn)物，并沒有什么實際的功能。而隨著技術水平的革新，目前已經(jīng)鑒定出不少具有特殊功能的非編碼RNA。對于小于200bp的RNA來說小RNA（miRNA）的功能是被研究最多的，而目前在hESC中對于大于200bp的長鏈非編碼RNA（lncRNA）的相關研究仍屬于起步階段，其中較為具有代表性的便是我科之前所完成的關于LincRNA-ROR的作用機制研究。對于長鏈非編碼RNA（lncRNA）來說，目前不少文獻報道了長鏈非編碼的作用機制，如參與基因組表觀遺傳學印記以及染色質(zhì)組蛋白修飾，轉(zhuǎn)錄起始的活性調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后水平RNA的調(diào)控，蛋白功能調(diào)節(jié)等多種重要的信號轉(zhuǎn)導調(diào)控過程，可以說是一片未被挖掘過的寶藏，值得我們進一步探究發(fā)現(xiàn)新的lncRNA的新作用機制，以更進一步地理解ESC的多能性調(diào)控。 以往對于ncRNA的功能研究常只集中在一條ncRNA的某一個靶上。而隨著技術理念的不斷革新，發(fā)現(xiàn)了許多ncRNA相互之間互相調(diào)控的實例，其中內(nèi)源性競爭性RNA（ceRNA）理念的提出與發(fā)現(xiàn)為細胞內(nèi)基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡增添了一個新的層面。以往對于miRNA的研究只集中在其一個靶上，但不斷有人證明發(fā)現(xiàn)單一miRNA的靶可以對應成千上萬個mRNA或lncRNA，而一條RNA也可能同時受到多條miRNA的調(diào)控。以此為依據(jù)所能構建起的是一個miRNA與mRNA及l(fā)ncRNA相互作用的網(wǎng)絡，而影響其網(wǎng)絡中的任一成分均會對該網(wǎng)絡的平衡造成很大影響，出現(xiàn)表型的變化。 ESC的干性調(diào)控網(wǎng)絡也同樣存在這種機制。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)lincROR具有競爭內(nèi)源mir-145的作用來提高ESC的多能性。而本課題的主要內(nèi)容就是進一步研究挖掘ESC干性調(diào)控網(wǎng)絡中的重要組成成分。首先從發(fā)掘新的影響ESC干性調(diào)控的miRNA入手，通過生物信息學高通量篩選以核心轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Nanog，Sox2為靶標中心的miRNA并驗證其功能。然后對ESC中具有高豐度，干性喪失后迅速下調(diào)的lncRNA進行篩選與功能鑒定，找到了一條與ESC多能性維持與自我更新密切相關的lncRNA-GAS5。最后，我們發(fā)現(xiàn)了GAS5影響ESC自我更新的方式主要是通過其轉(zhuǎn)錄后吸附大量促分化miRNA進行的。至此構建出一個以lncRNA-GAS5競爭促分化miRNA調(diào)控hESCs多能性的內(nèi)源miRNA競爭性調(diào)控網(wǎng)絡。 第一部分：多能性因子靶向性小RNA對hESC的影響研究 方法：（1）通過檢索NCBI GEOdatabase找到與hESC分化前后miRNA表達芯片數(shù)據(jù)（GSE14473），通過芯片分析軟件高通量篩查分化中明顯上調(diào)的miRNA。（2）利用miRNA靶位點預測軟件miRanda預測66個候選miRNA與多能性因子Oct4，Nanog，Sox2的結合，從中找出miRNA進行后續(xù)研究。（3）利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)及過表達miRNA模擬體實驗驗證候選miRNA的功能。（4）通過構建hESC的分化模型，研究mir-149及mir-320在分化后的表達變化，同時通過AP染色、免疫熒光檢測SSEA4實驗研究其對hESC多能性的影響。（5）利用mir-149及mir-320的模擬體及抑制劑研究其表達變化多hESC的分化趨勢的影響。 結果：（1）通過芯片分析軟件對芯片數(shù)據(jù)進行處理，同時利用聚類分析篩查出66條在8種不同hESC細胞系以及1種畸胎瘤細胞系中隨分化而發(fā)生明顯上調(diào)的miRNA。（2）構建66條miRNA的fasta數(shù)據(jù)庫，利用miRanda靶位點預測軟件的高通量預測能力篩查與多能性因子Oct4，Nanog，Sox2的結合，發(fā)現(xiàn)其中6條具有較強相關性，作為候選研究對象。（3）雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱斑^表達實驗均顯示mir-149及mir-320能夠有效抑制Oct4的mRNA及蛋白表達水平。（4）通過real-time檢測我們發(fā)現(xiàn)mir-149及mir-320的表達隨分化程度不斷升高，與Oct4及其它多能性因子的變化呈負相關，進一步提示其對hESC的促分化作用。（5）在過表達mir-149及mir-320后我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)外胚層的相關marker均發(fā)生明顯的上調(diào)，而對比Oct4干擾的結果我們發(fā)現(xiàn)mir-149及mir-320的促神經(jīng)外胚層分化作用不僅是通過下調(diào)Oct4引起的，利用生物信息學預測及實驗篩選，我們發(fā)現(xiàn)了另一個分化關鍵基因，β-catenin，受到mir-149及mir-320的調(diào)控。 結論：我們通過高通量的手段篩查既有芯片數(shù)據(jù)，對芯片數(shù)據(jù)進行深入挖掘，同時輔以生物信息學預測手段，最終通過一系列實驗研究找到并驗證了兩條未在hESC中報道的小RNA mir-149及mir-320具有靶向多能性因子Oct4，并促進hESC分化的作用。此外，在對mir-149及mir-320在分化中的功能進行深入研究后發(fā)現(xiàn)，mir-149及mir-320能夠特異地抑制分化后β-catenin的表達，，促進hESC向神經(jīng)方向分化，進一步揭示了miRNA在hESC中作用的重要性。第二部分：LncRNA-GAS5在hESC中對多能性的影響研究 方法：（1）通過高通量測序技術檢測hESC中分化前后差異表達的lncRNA。（2）構建部分篩選出的lncRNA過表達載體，并于hESC中進行過表達，通過real-time PCR檢測其對多能性基因的影響。（3）構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GAS5過表達及干擾的hESC細胞株，并對該細胞株進行表型變化的鑒定。（4）對發(fā)現(xiàn)表型變化的GAS5進行深入研究，通過cck8，流式細胞周期，AP染色檢測hESC的多能性在GAS5過表達及干擾下的變化。（5）通過原位雜交、核質(zhì)分離技術研究GAS5在hESC分化前后的細胞定位。 結果：（1）通過對高通量RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，挑選出分化前后具有較大變化的lncRNA。（2）構建DANCR、LOC100506647、LINC00458、GAS5的過表達載體，并于hESC中進行過表達，通過real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)GAS5能夠顯著上調(diào)多能性基因Oct4，Nanog與Sox2。（3）轉(zhuǎn)染GAS5過表達慢病毒及干擾慢病毒，通過熒光顯微鏡觀察每代標簽蛋白GFP的變化，同時通過篩選標記Puro進行篩選。鑒定出穩(wěn)定的hESC細胞株用于后續(xù)實驗。同時通過觀察研究穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的表型特點發(fā)現(xiàn)過表達GAS5的hESCs增殖較快，細胞克隆密集；而干擾的細胞株則呈現(xiàn)出相反的狀態(tài)。（4）CCK-8、流式細胞周期檢測顯示在過表達GAS5后hESC的增殖明顯加快，同時S期的細胞明顯增多。AP染色顯示過表達GAS5后hESC克隆明顯增多，多能性增強，干擾后克隆數(shù)明顯減少。（5）原位雜交及核質(zhì)分離實驗結果顯示GAS5主要聚集于胞質(zhì)中，隨hESC的分化胞質(zhì)GAS5的量發(fā)生明顯下調(diào)且與多能性成正相關。 結論：通過高通量RNA-seq的優(yōu)勢，準確找出了在hESC分化前后產(chǎn)生明顯差異的lncRNA。通過挑選個別表達豐度較高的lncRNA進行功能鑒定，成功地發(fā)現(xiàn)了GAS5具有促進hESC自我更新及多能性的作用。而對其亞細胞水平定位的分析則揭示了GAS5胞質(zhì)中的水平與多能性因子的關系，為后續(xù)機制實驗打下基礎。 第三部分：GAS5通過競爭內(nèi)源性小RNA促進hESC的多能性 方法：（1）通過高通量測序研究與GAS5共表達的基因，對共表達基因進行進一步的生物信息學分析，找出與GAS5作用相關的因子或信號通路。（2）通過RNA-IP技術檢測GAS5過表達或干擾情況下NODAL的mRNA上AGO-2蛋白的結合變化。干擾Dicer酶研究GAS5的表達變化對hESC自我更新的作用。（3）利用高通量測序技術篩選與GAS5及NODAL結合的miRNA并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C。過表達預測的候選miRNA，研究其對GAS5、NODAL以及hESC多能性的變化。（4）研究GAS5的上游，通過過表達多能性因子找到啟動GAS5高表達的原因，通過chIP，EMSA等實驗進行驗證，構建完整的GAS5對hESCs多能性作用的機制網(wǎng)絡圖。 結果：（1）對測序結果進行聚類分析發(fā)現(xiàn)共表達基因中有與多能性維持相關的信號通路關鍵基因如NODAL、TGFB3，還有與增殖相關的基因CDK4。對該部分基因進行GO功能分析發(fā)現(xiàn)與SMAD通路的激活具有高度相關性，對信號通路進行蛋白水平檢測分析則顯示NODAL-TGFbeta-SMAD2/3該通路在GAS5過表達下受到激活起到多能性維持的重要作用。（2）干擾Dicer酶后miRNA總量發(fā)生明顯下調(diào)，在此情況下過表達或干擾GAS5對多能性因子Oct4，NANOG與Sox2的促進作用相對弱于未干擾Dicer組。RNA-IP結果顯示GAS5過表達后NODAL的mRNA上AGO-2蛋白的結合明顯降低，干擾后明顯升高，提示GAS5能夠競爭結合于NODAL上的AGO-2-miRNA復合體。（3）通過高通量測序技術篩選出與GAS5及NODAL高度相關的miRNA共56條，設立評分系統(tǒng)，挑選評分最高的10條miRNA進行雙熒光素酶實驗驗證靶向性。通過雙熒光素酶報告基因的實驗驗證了其作用。（4）研究GAS5的上游會否被OCT4以及SOX2結合啟動，行chIP及過表達多能性因子等相關實驗進行分析和驗證。 結論：實驗結果顯示GAS5的促多能性促自我更新作用與NODAL的變化明顯相關，并且其影響NODAL的作用與miRNA的變化亦密切相關，此外hESC多能性的上調(diào)在miRNA總量下調(diào)后變化不明顯，提示GAS5有可能通過抑制NODAL靶向性miRNA從而上調(diào)hESC整體多能性水平，促進hESC的多能性及自我更新。通過miRNA-seq與生物信息學技術的結合，我們找到并驗證出了GAS5及NODAL之間共享的抑制性miRNA。隨后我們通過生物信息學分析偶然發(fā)現(xiàn)GAS5能夠被Oct4與Sox2結合并啟動轉(zhuǎn)錄，形成一條hESCs中的前饋性回路。最后我們的實驗結果表明GAS5能夠通過競爭抑制這些共享的抑制性miRNA提高NODAL的表達水平促進多能性因子的表達，而多能性因子中Oct4與Sox2亦能夠反過來啟動GAS5轉(zhuǎn)錄，形成一條前饋性回路，從而促進hESC的自我更新及多能性。 小結 本研究通過高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了mir-149、mir-320在hESC中隨分化程度增加而發(fā)生明顯上調(diào)，同時在未分化時其過表達能夠影響hESC的自我更新及多能性。通過生物信息學預測以及功能實驗驗證了其靶向Nanog、Oct4mRNA的作用，同時在對其促分化作用進行深入研究時發(fā)現(xiàn)mir-149及mir-320在神經(jīng)分化方向上的重要作用。本研究成功篩選并驗證了lncRNA-GAS5能夠影響hESC的自我更新及多能性。盡管GAS5曾被多次報道在不同腫瘤及正常組織中抑制細胞的增殖，并與GR的功能抑制有關，但在ESC中我們驗證并發(fā)現(xiàn)了其促自我更新的能力與其在胞質(zhì)中的大量聚集有關，而與GR的抑制無關。通過高通量測序技術輔以功能驗證我們發(fā)現(xiàn)GAS5能夠通過競爭部分miRNA促進多能性因子的表達，從而促進表型的變化。本研究首次提出并證實了GAS5能夠通過競爭多能性因子靶向性miRNA，提高多能性維持關鍵通路中NODAL的表達水平，從而影響多能性基因，并最終影響hESC多能性這一調(diào)控機制，為深入理解hESC多能性調(diào)控網(wǎng)絡以及內(nèi)源競爭性機制作出重要貢獻。
【關鍵詞】：人胚胎干細胞 小RNA 長鏈非編碼RNA 多能性 NODAL
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要5-10
• Abstract10-16
• 縮略詞表16-18
• 第一部分：多能性因子靶向性小 RNA 對 hESC 的影響研究18-45
• 一、前言18-19
• 二、材料與方法19-34
• 三、結果34-43
• 四、討論43-45
• 第二部分：LncRNA-GAS5 對 hESC 干性維持的影響研究45-60
• 一、前言45-46
• 二、材料與方法46-52
• 三、結果52-58
• 四、討論58-60
• 第三部分：GAS5 通過競爭內(nèi)源 miRNA 促進 hESC 的多能性60-74
• 一、前言60-61
• 二、材料與方法61-66
• 三、結果66-72
• 四、討論72-74
• 附錄74-78
• 文獻綜述78-87
• 參考文獻87-97
• 在讀期間論文發(fā)表和科研工作情況說明97-98
• 致謝98-99

【共引文獻】

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本文編號：716462