本文關(guān)鍵詞：大鼠miR-21慢病毒載體的構(gòu)建及其在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達

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【摘要】：目的采用分子生物學方法構(gòu)建miR-21慢病毒載體,并感染骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs),建立穩(wěn)定表達miR-21的MSCs細胞系。方法合成大鼠miR-21基因序列,進行PCR擴增后,連接到慢病毒表達質(zhì)粒p LVX-shRNA2中。對其進行雙酶切及基因測序鑒定,證實載體p LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p的成功構(gòu)建。對載體進行包裝、測定病毒滴度。分4組:MSCs組不轉(zhuǎn)染病毒液,空載組轉(zhuǎn)染空載病毒液,miR-21組1用miR-21慢病毒載體以MOI 20轉(zhuǎn)染MSCs,miR-21組2用miR-21慢病毒載體以MOI 40轉(zhuǎn)染MSCs。將慢病毒顆粒以不同感染復數(shù)(MOI)感染MSCs,檢測感染效率,使用實時定量PCR法檢測MSCs中miR-21的表達。結(jié)果目的基因與慢病毒載體成功連接。病毒滴度約為6×10~8CFU/m L。載體成功感染MSCs,轉(zhuǎn)染效率達90%以上。實時定量PCR檢測結(jié)果證實miR-21組1(MOI為20)、miR-21組2(MOI為40)miR-21表達量分別為4.05±0.07、4.06±0.04,與MSCs組(1.07±0.05)及空載組(1.12±0.05)相比差異有統(tǒng)計學意義(F=3 014.962,P=0.000)。結(jié)論采用分子生物學方法成功構(gòu)建了大鼠miR-21慢病毒載體系統(tǒng)p LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p,并成功轉(zhuǎn)染MSCs,得到穩(wěn)定表達miR-21的MSCs細胞系,從而為進一步研究miR-21的生物學特性提供實驗基礎。
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科;
【關(guān)鍵詞】： miR- 慢病毒 骨髓間充質(zhì)干細胞 大鼠
【基金】：國家自然科學基金資助項目(編號:81300462) 廣東省科技計劃項目(編號:2012B031800123) 廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目育苗工程(編號:2012LYM_0034)
【分類號】：R373
【正文快照】： 微小RNAs(miRNAs)是存在于真核生物中的由18~25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,其功能是參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,通過與靶mRNA的堿基配對,導致靶mRNA的降解或翻譯抑制,從而進行基因表達的調(diào)控[1]。研究證實miRNAs參與細胞的增殖與凋亡、器官發(fā)育、分化等重要生物學事

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