本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建和表達(dá)抗HSV-2單鏈抗體和堿性磷酸酶的融合蛋白

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【摘要】：單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)分為單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)兩種類型,可以感染皮膚、黏膜以及多種器官。絕大多數(shù)生殖器皰疹(genital herpes,GH)是由HSV-2感染引起,但由HSV-1感染引起的GH比例在增加。HSV-2感染目前是不可治愈的,主要通過(guò)性接觸水平傳播和母嬰垂直傳播,傳染性極強(qiáng)且會(huì)反復(fù)發(fā)作,皰疹發(fā)作產(chǎn)生的潰瘍是生殖器潰瘍的主要病因之一,流行病學(xué)證據(jù)表明HSV-2感染與宮頸癌和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染都有密切的關(guān)系。HSV-2在人群中有著很高的感染率和發(fā)病率,世界衛(wèi)生組織發(fā)布的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示2003年全球15歲至49歲年齡段人群中,HSV-2感染率約為16.2%,發(fā)病率約為0.7%,并且都有不斷上升的趨勢(shì)。因此,建立一種簡(jiǎn)便、快速、低成本的HSV-2初篩方法,對(duì)GH的輔助診斷和控制傳播具有重要的意義。 為探索本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的特異性抗HSV-2糖蛋白B的單鏈抗體在GH診斷中的實(shí)用價(jià)值,本研究將該單鏈抗體基因克隆入原核表達(dá)載體pLac-duet-1-AKP中構(gòu)建了抗HSV-2單鏈抗體和堿性磷酸酶的融合表達(dá)載體pLac-H3-AKP,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)獲得表達(dá),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE顯示在破菌沉淀中有符合預(yù)期大小的約75kD大小的新生蛋白帶。將包涵體裂解后用鎳離子螯合層析純化變性的融合蛋白,并初步探索出該融合蛋白的最佳復(fù)性條件：復(fù)性緩沖液(50mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,10mmol/L β-巰基乙醇,0.5mol/L尿素,0.5mol/L精氨酸,lmmol/L GSSG和3mmol/L GSH,pH7.5),蛋白的初始復(fù)性濃度為0.13mg/mL,4℃復(fù)性24h。復(fù)性后的融合蛋白不僅能與HSV-2糖蛋白B抗原特異結(jié)合而且具有堿性磷酸酶的指示酶活性,為快速檢測(cè)HSV-2抗原提供了一種有效的方法。
【關(guān)鍵詞】：HSV-2 單鏈抗體 堿性磷酸酶 融合蛋白 蛋白復(fù)性
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 縮寫說(shuō)明13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-25
• 1.1 單純皰疹病毒Ⅱ型與生殖器皰疹14
• 1.2 單鏈抗體及其應(yīng)用14-16
• 1.2.1 單鏈抗體簡(jiǎn)介14-15
• 1.2.2 單鏈抗體的應(yīng)用15-16
• 1.3 大腸桿菌原核表達(dá)16-17
• 1.3.1 可溶性表達(dá)及包涵體表達(dá)16-17
• 1.3.2 提高可溶性表達(dá)的方法17
• 1.4 包涵體復(fù)性17-22
• 1.4.1 包涵體的形成17-18
• 1.4.2 包涵體的可利用之處18
• 1.4.3 復(fù)性的概念18
• 1.4.4 影響復(fù)性的因素18-20
• 1.4.5 復(fù)性的主要方法20-22
• 1.5 研究計(jì)劃22-25
• 1.5.1 研究?jī)?nèi)容22-23
• 1.5.2 技術(shù)路線23
• 1.5.3 擬突破難點(diǎn)23-24
• 1.5.4 創(chuàng)新點(diǎn)24-25
• 第二章 建立堿性磷酸酶比活標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照25-39
• 2.1 引言25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料25-29
• 2.2.1 菌株25-26
• 2.2.2 培養(yǎng)基26
• 2.2.3 主要試劑26-28
• 2.2.4 主要儀器28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 2.3.1 pET43.1-AKP的可溶性表達(dá)29
• 2.3.2 金屬螯合層析純化AKP29-30
• 2.3.3 12%SDS-PAGE電泳30-33
• 2.3.4 AKP儲(chǔ)存液透析AKP33
• 2.3.5 AKP比活測(cè)定33-35
• 2.4 結(jié)果與分析35-38
• 2.4.1 AKP可溶表達(dá)的定位35-36
• 2.4.2 AKP金屬螯合層析純化效果36-37
• 2.4.3 AKP比活測(cè)定37-38
• 2.4.4 比活計(jì)算38
• 2.5 小結(jié)38-39
• 第三章 融合表達(dá)載體pLac-H3-AKP的構(gòu)建39-49
• 3.1 引言39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料39-41
• 3.2.1 菌株及質(zhì)粒39
• 3.2.2 培養(yǎng)基39-40
• 3.2.3 主要試劑40
• 3.2.4 主要儀器40-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法41-46
• 3.3.1. pLac-duet-1-AKP的擴(kuò)增41-42
• 3.3.2 pCANTAB5E-H3的擴(kuò)增42-43
• 3.3.3 兩個(gè)質(zhì)粒的雙酶切43-44
• 3.3.4 雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳44
• 3.3.5 基因片段的凝膠回收44-45
• 3.3.6 基因片段的連接45
• 3.3.7 pLac-H3-AKP的雙酶切鑒定45-46
• 3.4 結(jié)果與分析46-48
• 3.5 小結(jié)48-49
• 第四章 融合蛋白的表達(dá)49-57
• 4.1 引言49
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 4.2.1 主要試劑49
• 4.2.2 主要儀器49-50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 4.3.1 pLac-H3-AKP表達(dá)菌的構(gòu)建50
• 4.3.2 融合蛋白的可溶性表達(dá)嘗試50-51
• 4.3.3 融合蛋白的包涵體表達(dá)51
• 4.3.4 包涵體的洗滌51
• 4.3.5 包涵體的變性51-52
• 4.3.6 變性融合蛋白的金屬螯合層析52
• 4.4 結(jié)果與分析52-56
• 4.4.1 融合蛋白的可溶性表達(dá)52-53
• 4.4.2 融合蛋白的包涵體表達(dá)53-54
• 4.4.3 包涵體的洗滌54
• 4.4.4 變性融合蛋白的金屬螯合層析54-56
• 4.5 小結(jié)56-57
• 第五章 融合蛋白的復(fù)性57-64
• 5.1 引言57
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料57-58
• 5.2.1 主要試劑57
• 5.2.2 主要儀器57-58
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 5.3.1 復(fù)性條件的篩選58
• 5.3.2 復(fù)性后融合蛋白的分析鑒定58-59
• 5.4 結(jié)果與分析59-63
• 5.4.1 不同pH值對(duì)復(fù)性效果的影響59
• 5.4.2 不同初始復(fù)性蛋白濃度對(duì)復(fù)性效果的影響59-60
• 5.4.3 不同GSSG/GSH比例對(duì)復(fù)性效果的影響60-61
• 5.4.4 不同時(shí)間對(duì)復(fù)性效果的影響61
• 5.4.5 8%SDS-PAGE分析61-62
• 5.4.6 抗原結(jié)合活性鑒定62-63
• 5.5 小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 附錄72-73
• 致謝73-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文74

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