本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制劑篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： SHP-1 抑制劑 高通量篩選 J11310 糖尿病 葡萄糖消耗 AMPK IRS

【摘要】：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs）是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子，與人類疾病密切相關(guān)。SHP-1是含有SH2結(jié)構(gòu)域的具有高度保守序列的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的亞家族中的重要成員，研究表明，PTPs與糖尿病患者血糖控制以及糖尿病血管并發(fā)癥關(guān)系密切。尋找蛋白酪氨酸磷酸酶的高活性抑制劑對糖尿病和肥胖癥治療有著廣闊的應(yīng)用前景。 本課題我們從人腦組織中獲取mRNA，通過RT-PCR擴增出目標(biāo)cDNA，構(gòu)建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆進(jìn)行驗證，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli Transetta感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)SHP-1，獲得具有生物活性的體外重組SHP-1蛋白。同時對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明20℃，0.4mmol/L IPTG對表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)時，SHP-1在體外高效穩(wěn)定的表達(dá)。采用我們體外表達(dá)獲得的蛋白建立SHP-1高通量篩選模型，對多種化合物用SHP-1抑制劑篩選模型進(jìn)行篩選，尋找高活性的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑，結(jié)果獲得活性化合物J11310。 實驗中以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和大鼠骨骼肌成肌L6細(xì)胞為研究對象，選用胰島素30nM作為陽性對照對照，評價了J11310對細(xì)胞糖代謝的影響。結(jié)果表明，樣品J11310對HepG2細(xì)胞和L6細(xì)胞無毒性，可劑量依賴性的促進(jìn)HepG2和L6細(xì)胞葡萄糖消耗，當(dāng)濃度為1μg/mL時能顯著性促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖消耗。提示樣品J11310的作用機制可能是通過促進(jìn)肝臟和外周對葡萄糖的利用起到降葡萄糖作用。在HepG2細(xì)胞中加入胰島素，控制樣品的有無，以羅格列酮10-5M為陽性對照，比較細(xì)胞葡萄糖消耗量以評價樣品有無胰島素的協(xié)同作用。結(jié)果顯示，J11310在HepG2細(xì)胞中有較好的胰島素協(xié)同性，作用強于羅格列酮，以1μg/mL作用最強，隨著濃度降低，樣品對葡萄糖消耗的協(xié)同作用逐漸減弱，在10-4μg/mL，10-5μg/mL時無協(xié)同作用。用不同濃度四氧嘧啶對RINm5F細(xì)胞進(jìn)行損傷，樣品不同濃度的J11310均對損傷的胰島細(xì)胞RINm5F無保護(hù)作用。用細(xì)胞免疫熒光方法檢測細(xì)胞中PGC-1α、Pi-AMPK、Pi-IRS的表達(dá)量，結(jié)果顯示，樣品J11310與HepG2細(xì)胞作用后，磷酸化AMPK以及磷酸化IRs表達(dá)量增加，對PGC-1a的表達(dá)量無明顯影響。這提示，J11310可能通過激活A(yù)MPK活性發(fā)揮葡萄糖脂代謝調(diào)控作用，同時還提高了IRS磷酸化水平，繼而激活下游胰島信號的傳遞，促進(jìn)血液中葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運而降低血糖含量。 以上研究工作為進(jìn)一步尋找發(fā)現(xiàn)SHP-1的高活性抑制劑，和評價化合物生物活性打下了基礎(chǔ)。同時為尋找治療糖尿病和肥胖癥的藥物提供新的研究思路，，有著重要的研究價值和應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：SHP-1 抑制劑 高通量篩選 J11310 糖尿病 葡萄糖消耗 AMPK IRS
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416;R587.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目錄8-11
• 前言11-21
• 參考文獻(xiàn)17-21
• 第一章 蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP-1 基因克隆與表達(dá)21-29
• 1. 實驗材料21
• 1.1 菌株與主要試劑21
• 1.2 主要儀器21
• 2. 實驗方法21-23
• 2.1 人 SHP-1 全長基因的克隆21-22
• 2.2 重組質(zhì)粒 SHP-1-pEASY-E1 的構(gòu)建及鑒定22
• 2.3 重組質(zhì)粒在原核細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定22-23
• 3. 實驗結(jié)果23-25
• 3.1 人源 SHP-1 cDNA 全長的克隆23
• 3.2 重組質(zhì)粒 SHP-1-pEASY-E1 的篩選與鑒定23-24
• 3.3 SHP-1 在原核細(xì)胞中的表達(dá)24
• 3.4 SHP-1 原核表達(dá)條件的優(yōu)化24-25
• 4. 小結(jié)與討論25-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 第二章 SHP-1 抑制劑篩選模型的建立與抑制劑的篩選29-37
• 1. 實驗材料29-30
• 1.1 菌株29
• 1.2 試劑29
• 1.3 主要儀器29
• 1.4 主要試劑的配制29-30
• 2. 實驗方法30
• 2.1 SHP-1 酶濃度測定30
• 2.2 SHP-1 酶促反應(yīng)動力學(xué)分析30
• 2.3 SHP-1 抑制劑高通量篩選模型的建立30
• 2.4 篩選模型的驗證與樣品 J11310 對 SHP-1 抑制率的測定30
• 3. 實驗結(jié)果30-32
• 3.1 SHP-1 的酶促反應(yīng)動力學(xué)分析30-31
• 3.2 SHP-1 抑制劑的篩選模型31-32
• 3.3 NaVO4 對 SHP-1 的抑制作用32
• 3.4 J11310 對 SHP-1 的抑制作用32
• 4．小結(jié)與討論32-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 第三章 酪氨酸磷酸酶抑制劑在細(xì)胞水平上降糖效果評價37-49
• 1. 實驗材料37-38
• 1.1 細(xì)胞37
• 1.2 藥品和試劑37-38
• 1.3 主要儀器38
• 1.4 主要試劑配制38
• 2. 實驗方法38-40
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)38
• 2.2 細(xì)胞活力的測定38-39
• 2.3 細(xì)胞葡萄糖消耗的測定39
• 2.4 胰島素的協(xié)同作用的測定39-40
• 3．實驗結(jié)果40-44
• 3.1 61 個樣品濃度為 10μg/mL 時對 HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響40-41
• 3.2 J11310 對 HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響41-43
• 3.3 樣品中對 HepG2 細(xì)胞胰島素協(xié)同作用的影響43-44
• 4．小結(jié)與討論44-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 第四章 酪氨酸磷酸酶抑制劑 J11310 降糖機制的研究49-60
• 1. 實驗材料49-50
• 1.1 細(xì)胞49
• 1.2 藥品和試劑49
• 1.3 主要試劑的配制49
• 1.4 主要儀器49-50
• 2. 實驗方法50-52
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)50
• 2.2 RINm5F 細(xì)胞四氧嘧啶損傷保護(hù)實驗50
• 2.3 細(xì)胞免疫熒光50-51
• 2.4 細(xì)胞總 RNA 的提取及濃度測定51
• 2.5 Real-time PCR51-52
• 3. 實驗結(jié)果52-56
• 3.1 J11310 對四氧嘧啶損傷 RINm5F 細(xì)胞的影響52-53
• 3.2 J11310 對 HepG2 細(xì)胞 PGC-1α，p-AMPK，p-IRS 表達(dá)量的影響53-54
• 3.3 J11310 對 HepG2 細(xì)胞中 SHP1 mRNA 表達(dá)的影響54-56
• 4. 小結(jié)與討論56-59
• 參考文獻(xiàn)59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張佳林;鐘嘉明;張成鈞;崔雪陽;;“永生化”胰島β細(xì)胞系研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2009年04期

2 王辰,王瀝,楊澤;蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)與2型糖尿病及肥胖的關(guān)系[J];遺傳;2004年06期

本文編號：689822