本文關(guān)鍵詞：VWF-A1的表達純化及其在力學環(huán)境中的功能研究

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【摘要】：在循環(huán)血流中，血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）通過介導高速流動的血小板在血管內(nèi)壁受損部位的粘附，在初始止血過程中起著至關(guān)重要的作用，是連接血小板與血管內(nèi)皮下膠原的橋梁。其中血小板的初始粘附依賴于VWF的A1結(jié)構(gòu)域與血小板表面糖蛋白受體（platelet glycoprotein Ibα，GPIbα）的相互作用，并在該過程中會伴隨著胞內(nèi)鈣信號的傳導，進而刺激白細胞上整合素的激活，并引起血小板的穩(wěn)定粘附和聚集。鑒于VWF-A1與血小板GPIbα的相互作用在凝血止血方面的重要性，本文以VWF-A1分子與血小板作為研究對象，平行平板流動腔作為研究手段，研究在不同剪應率條件下VWF-A1分子與血小板GPIbα的相互作用以及血小板的激活水平，從而對于在正常生理條件下的血流剪應力如何經(jīng)由GPIbα/VWF-A1來介導血小板的活化，進而發(fā)揮止血功能有更深入的認識。 首先，通過探索目的蛋白表達條件，并通過比較兩種不同的裂菌方法：溶菌酶破碎法及超聲波破碎法，，使目的蛋白能高效地以可溶性形式表達；進而經(jīng)過Ni柱親和層析純化蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鑒定純化蛋白的特異性及其純度，每100ml上清液可純化得到5.77mg VWF-A1純品，并具有較高的純度。 然后，采用流動腔實驗系統(tǒng)檢測其生物學功能。將純化的血小板（取自健康志愿者）以不同的流體剪切力（1~20dyn/cm2）灌注到底板做不同處理（分別鋪有BSA、PBS及100μg/ml的VWF-A1蛋白）的流動腔中。通過對比實驗，證實了血小板的粘附是由GPIb與VWFA1之間的特異性相互作用所介導的。從實驗結(jié)果可知，1%BSA能夠有效阻斷血小板與底板間的非特異性粘附，但不影響與VWF-A1間的特異性相互作用，因而后續(xù)實驗均采用此方法來進行流動腔底板功能化。 最后，仍然采用流動腔作為研究手段，通過將純化的血小板上染上熒光染料Fluo4-AM，該染料在有鈣離子的刺激時則會發(fā)生反應，即可觀測到熒光現(xiàn)象。再將其與其他血細胞混合后以不同流體剪切率（50~500s-1）灌注到底板經(jīng)功能化處理（含有1%BSA的120μg/ml的VWF-A1蛋白）的流動腔中。為驗證血小板的鈣響應事件是否具有力的依賴性，以及在不同剪應率條件下血小板的激活水平，我們通過分析相對熒光強度的變化來分析激活比率、激活時間、達峰時間、半衰期及相對峰值等參數(shù)來探討上述問題。實驗結(jié)果表明，血小板的激活的確具有力依賴性，此外我們還發(fā)現(xiàn)血小板的激活是由高剪切率所介導，隨著剪切率的增大，會呈現(xiàn)激活時間縮短、達峰更快、半衰期更短以及相對熒光強度增強的趨勢。
【關(guān)鍵詞】：VWF-A1 血小板 純化 流動腔 剪切率 相對熒光強度
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R331
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-12
• 第一章 緒論12-25
• 1.1 血管性血友病及其研究現(xiàn)狀12-14
• 1.1.1 血管性血友病的臨床表現(xiàn)及發(fā)病機理12
• 1.1.2 血管性血友病的分型12-14
• 1.2 血管性血友病因子的研究進展14-19
• 1.2.1 血管性血友病因子的合成與分泌14-15
• 1.2.2 血管性血友病因子的分子結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2.3 血管性血友病因子各結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)及功能16-19
• 1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀19-23
• 1.3.1 VWF-A1 與血小板相互作用的研究進展19-21
• 1.3.2 利用流動腔研究單分子對在流體剪應力下的相互作用21-23
• 1.4 科學問題的提出及論文的主要內(nèi)容23-25
• 1.4.1 科學問題的提出23-24
• 1.4.2 論文研究的主要內(nèi)容24
• 1.4.3 論文的結(jié)構(gòu)安排24-25
• 第二章 VWF-A1 分子在大腸桿菌中的可溶性表達及純化25-41
• 2.1 實驗材料25-28
• 2.1.1 質(zhì)粒與菌種25
• 2.1.2 試劑與耗材25
• 2.1.3 實驗儀器及設備25-26
• 2.1.4 實驗相關(guān)溶液的配制26-28
• 2.2 實驗方法28-35
• 2.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞28
• 2.2.2 質(zhì)粒小提28-29
• 2.2.3 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞29
• 2.2.4 挑單克隆菌株及擴大培養(yǎng)29-30
• 2.2.5 兩種方法探索目的蛋白 VWF-A1 的可溶性表達30-31
• 2.2.6 VWF-A1 的純化31-32
• 2.2.7 12 % SDS-PAGE 鑒定親和層析純化的 VWF-A1 的純度32-33
• 2.2.8 Western-blot 測定純化產(chǎn)品的免疫活性33-34
• 2.2.9 BCA 試劑盒對目的蛋白定量34-35
• 2.3 實驗結(jié)果35-39
• 2.3.1 兩種方法誘導 VWF-A1 的可溶性表達35-36
• 2.3.2 SDS-PAGE、Western-blot 鑒定親和層析純化的結(jié)果36-38
• 2.3.3 目的蛋白的定量結(jié)果38-39
• 2.4 討論39-40
• 2.5 本章小結(jié)40-41
• 第三章 VWF-A1 與血小板結(jié)合的功能鑒定41-49
• 3.1 實驗材料41-43
• 3.1.1 血小板與蛋白分子41
• 3.1.2 試劑與耗材41
• 3.1.3 實驗儀器及設備41-43
• 3.2 實驗方法43-45
• 3.2.1 血小板的提取與純化43-44
• 3.2.2 平行平板流動腔實驗準備44
• 3.2.3 VWF-A1 與血小板的特異性相互作用44-45
• 3.3 實驗結(jié)果45-47
• 3.4 討論47-48
• 3.5 本章小結(jié)48-49
• 第四章 VWF-A1 在力學環(huán)境下介導的血小板鈣信號激活49-62
• 4.1 實驗材料49-51
• 4.1.1 血小板與蛋白分子49
• 4.1.2 試劑與耗材49
• 4.1.3 實驗儀器及設備49-50
• 4.1.4 實驗相關(guān)溶液的配制50-51
• 4.2 實驗方法51-55
• 4.2.1 血樣的準備51-52
• 4.2.2 平行平板流動腔實驗準備52
• 4.2.3 VWF-A1 介導的血小板鈣信號激活的流動腔實驗52-55
• 4.3 實驗結(jié)果55-59
• 4.3.1 血小板鈣信號的激活具有力的依賴性55-56
• 4.3.2 在力學環(huán)境下血小板鈣信號激活的不同類型56-57
• 4.3.3 流體剪切率調(diào)控血小板鈣信號激活時間57-58
• 4.3.4 流體剪切率調(diào)控血小板鈣信號激活水平58-59
• 4.4 討論59-61
• 4.5 本章小結(jié)61-62
• 總結(jié)與展望62-64
• 參考文獻64-72
• 攻讀碩士期間取得的研究成果72-73
• 致謝73-74
• 附件74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 呂守芹;楊帆;龍勉;;細胞-分子生物力學研究進展[J];醫(yī)用生物力學;2009年02期

2 楊小芳;丁孝茹;吳建華;方穎;;vWF-A1A2A3介導循環(huán)血小板翻滾運動的機制研究[J];醫(yī)用生物力學;2013年05期

本文編號：685873