本文關(guān)鍵詞：PIF1解螺旋酶在DNA損傷修復(fù)中的作用

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【摘要】：目的：利用PIF1敲低細(xì)胞系，研究PIF1蛋白與細(xì)胞周期及輻射應(yīng)答之間的關(guān)系；構(gòu)建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）截短體真核表達(dá)重組質(zhì)粒，，進(jìn)行真核表達(dá)，并確定PIF1、PIF1C、PIF1N在細(xì)胞內(nèi)定位；設(shè)計(jì)能抑制PIF1的SiRNA序列，構(gòu)建SiRNA真核表達(dá)載體，鑒定為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備；DR-GFP-U2OS細(xì)胞模型雙鍵斷裂損傷后，分別敲低、過(guò)表達(dá)PIF1、及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）。檢測(cè)綠熒光變化。明確PIF1在DNA雙鏈斷裂損傷中同源重組修復(fù)中的作用。 方法：HeLa細(xì)胞經(jīng)TDR雙阻斷后，不同時(shí)間點(diǎn)收細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期同步化時(shí)相，Westernblot檢測(cè)PIF1蛋白的變化。HeLa細(xì)胞進(jìn)行60Coγ射線不同劑量照射，按時(shí)間點(diǎn)收細(xì)胞，Western blot檢測(cè)PIF1蛋白的變化水平；PIF1敲低細(xì)胞系及對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)TDR雙阻斷后，分別在不同時(shí)間點(diǎn)收細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期各時(shí)相細(xì)胞所占比例。PIF1敲低細(xì)胞系及對(duì)照組細(xì)胞分別進(jìn)行4、20Gy照射，照射后分別在0、24h、48h收細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；以HeLa cDNA為模板PCR獲取PIF1、PIF1C、PIF1N編碼區(qū)cDNA,將其插入pCMV-Tag2B質(zhì)粒中構(gòu)建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達(dá)重組質(zhì)粒；通過(guò)lipofectamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞中，Western blot方法檢測(cè)其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，用免疫熒光的方法檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)定位；將設(shè)計(jì)好的抑制PIF1的SiRNA序列送公司合成后，Western blot檢測(cè)，確定敲低序列；將低敲的PIF1siRNA、過(guò)表達(dá)的PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達(dá)重組質(zhì)粒通過(guò)lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)入DR GFP U2OS細(xì)胞中，24h后再分別轉(zhuǎn)入I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒，48h后檢測(cè)綠熒光蛋白的強(qiáng)度變化。 結(jié)果：雙阻斷后，PIF1蛋白的含量在S期顯著升高。進(jìn)行60Coγ射線照射后，各劑量PIF1蛋白均有先下降后升高的趨勢(shì)，2Gy在2h左右蛋白含量下降，4h左右開(kāi)始升高，，4Gy在2h左右蛋白含量下降，6h左右開(kāi)始升高，10Gy在2h左右蛋白含量下降，10h左右開(kāi)始升高；敲低細(xì)胞系在G2/M期的含量明顯高于對(duì)照組，照射后，敲低組細(xì)胞凋亡率48h內(nèi)明顯升高；成功構(gòu)建PIF1及其截短體真核表達(dá)重組體，并在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。確定PIF1定位于整個(gè)細(xì)胞，呈彌散狀分布，PIF1解螺旋酶模序主要定位于胞漿中，PIF1PINT結(jié)構(gòu)域主要定位于核周；成功構(gòu)建了抑制PIF1的SiRNA，并在真核細(xì)胞中成功表達(dá)；敲低組PIF1的綠熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，敲低又過(guò)表達(dá)PIF1的綠熒光強(qiáng)度較敲低組略有升高，PIF1、PIF1C、PIF1N的綠熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，但PIF1、PIF1N的熒光強(qiáng)度相近且高于PIF1C。 結(jié)論：1.PIF1在細(xì)胞周期S期表達(dá)量升高，可能與細(xì)胞的復(fù)制有關(guān)。2.PIF1影響細(xì)胞周期的G2/M期進(jìn)程，敲低PIF1細(xì)胞周期變慢。3.PIF1調(diào)控輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與輻射應(yīng)答有關(guān)，敲低PIF1導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高。4.真核細(xì)胞中成功表達(dá)了PIF1、PIF1C、PIF1N，且發(fā)現(xiàn)PIF1的PINT結(jié)構(gòu)域?qū)IF1的入核起重要作用。5.PIF1、PIF1的PINT功能域和解螺旋酶序?qū)SBs的同源重組修復(fù)都有一定的作用，但PIF1的PINT結(jié)構(gòu)域起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：解螺旋酶 PIF1 重組質(zhì)粒 蛋白表達(dá) 免疫熒光 流式細(xì)胞術(shù)
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 目錄8-9
• 主要英文縮略語(yǔ)索引9-10
• 前言10-14
• 材料與方法14-25
• 1. 材料14-18
• 2．實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 結(jié)果25-37
• 1.同步化 HeLa 細(xì)胞后 PIF1 蛋白在 S 期明顯升高25-26
• 2.不同劑量γ射線照射 HeLa 細(xì)胞后 PIF1 蛋白的產(chǎn)生和量變時(shí)間效應(yīng)26-27
• 3.PIF1 敲低減緩細(xì)胞周期進(jìn)程27-28
• 4.PIF1 敲低導(dǎo)致電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡升高28-30
• 5.過(guò)表達(dá) PIF1 及其截短體重組質(zhì)粒的構(gòu)建30-33
• 6.敲低 PIF1 蛋白的 SiRNA 的鑒定33-34
• 7.PIF1 蛋白對(duì)綠熒光蛋白的熒光強(qiáng)度的影響34-37
• 討論37-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 文獻(xiàn)綜述43-54
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 致謝54-55
• 作者簡(jiǎn)介55-57
• 導(dǎo)師評(píng)閱表57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Frank GROSSE;Multiple Functions of Nuclear DNA Helicase Ⅱ (RNA Helicase A) in Nucleic Acid Metabolism[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年03期

本文編號(hào)：672339