本文關(guān)鍵詞：PIF1解螺旋酶在DNA損傷修復(fù)中的作用

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【摘要】：目的：利用PIF1敲低細胞系，研究PIF1蛋白與細胞周期及輻射應(yīng)答之間的關(guān)系；構(gòu)建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）截短體真核表達重組質(zhì)粒，，進行真核表達，并確定PIF1、PIF1C、PIF1N在細胞內(nèi)定位；設(shè)計能抑制PIF1的SiRNA序列，構(gòu)建SiRNA真核表達載體，鑒定為下一步實驗做準備；DR-GFP-U2OS細胞模型雙鍵斷裂損傷后，分別敲低、過表達PIF1、及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）。檢測綠熒光變化。明確PIF1在DNA雙鏈斷裂損傷中同源重組修復(fù)中的作用。 方法：HeLa細胞經(jīng)TDR雙阻斷后，不同時間點收細胞，流式細胞儀檢測細胞周期同步化時相，Westernblot檢測PIF1蛋白的變化。HeLa細胞進行60Coγ射線不同劑量照射，按時間點收細胞，Western blot檢測PIF1蛋白的變化水平；PIF1敲低細胞系及對照組細胞經(jīng)TDR雙阻斷后，分別在不同時間點收細胞，流式細胞儀檢測周期各時相細胞所占比例。PIF1敲低細胞系及對照組細胞分別進行4、20Gy照射，照射后分別在0、24h、48h收細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；以HeLa cDNA為模板PCR獲取PIF1、PIF1C、PIF1N編碼區(qū)cDNA,將其插入pCMV-Tag2B質(zhì)粒中構(gòu)建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達重組質(zhì)粒；通過lipofectamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人293細胞中，Western blot方法檢測其在真核細胞內(nèi)的表達，用免疫熒光的方法檢測其細胞內(nèi)定位；將設(shè)計好的抑制PIF1的SiRNA序列送公司合成后，Western blot檢測，確定敲低序列；將低敲的PIF1siRNA、過表達的PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達重組質(zhì)粒通過lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)入DR GFP U2OS細胞中，24h后再分別轉(zhuǎn)入I-SceI的表達質(zhì)粒，48h后檢測綠熒光蛋白的強度變化。 結(jié)果：雙阻斷后，PIF1蛋白的含量在S期顯著升高。進行60Coγ射線照射后，各劑量PIF1蛋白均有先下降后升高的趨勢，2Gy在2h左右蛋白含量下降，4h左右開始升高，，4Gy在2h左右蛋白含量下降，6h左右開始升高，10Gy在2h左右蛋白含量下降，10h左右開始升高；敲低細胞系在G2/M期的含量明顯高于對照組，照射后，敲低組細胞凋亡率48h內(nèi)明顯升高；成功構(gòu)建PIF1及其截短體真核表達重組體，并在真核細胞內(nèi)成功表達。確定PIF1定位于整個細胞，呈彌散狀分布，PIF1解螺旋酶模序主要定位于胞漿中，PIF1PINT結(jié)構(gòu)域主要定位于核周；成功構(gòu)建了抑制PIF1的SiRNA，并在真核細胞中成功表達；敲低組PIF1的綠熒光強度低于對照組，敲低又過表達PIF1的綠熒光強度較敲低組略有升高，PIF1、PIF1C、PIF1N的綠熒光強度高于對照組，但PIF1、PIF1N的熒光強度相近且高于PIF1C。 結(jié)論：1.PIF1在細胞周期S期表達量升高，可能與細胞的復(fù)制有關(guān)。2.PIF1影響細胞周期的G2/M期進程，敲低PIF1細胞周期變慢。3.PIF1調(diào)控輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡，與輻射應(yīng)答有關(guān)，敲低PIF1導(dǎo)致細胞凋亡率升高。4.真核細胞中成功表達了PIF1、PIF1C、PIF1N，且發(fā)現(xiàn)PIF1的PINT結(jié)構(gòu)域?qū)IF1的入核起重要作用。5.PIF1、PIF1的PINT功能域和解螺旋酶序?qū)SBs的同源重組修復(fù)都有一定的作用，但PIF1的PINT結(jié)構(gòu)域起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：解螺旋酶 PIF1 重組質(zhì)粒 蛋白表達 免疫熒光 流式細胞術(shù)
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 目錄8-9
• 主要英文縮略語索引9-10
• 前言10-14
• 材料與方法14-25
• 1. 材料14-18
• 2．實驗方法18-24
• 3.統(tǒng)計學分析24-25
• 結(jié)果25-37
• 1.同步化 HeLa 細胞后 PIF1 蛋白在 S 期明顯升高25-26
• 2.不同劑量γ射線照射 HeLa 細胞后 PIF1 蛋白的產(chǎn)生和量變時間效應(yīng)26-27
• 3.PIF1 敲低減緩細胞周期進程27-28
• 4.PIF1 敲低導(dǎo)致電離輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡升高28-30
• 5.過表達 PIF1 及其截短體重組質(zhì)粒的構(gòu)建30-33
• 6.敲低 PIF1 蛋白的 SiRNA 的鑒定33-34
• 7.PIF1 蛋白對綠熒光蛋白的熒光強度的影響34-37
• 討論37-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-43
• 文獻綜述43-54
• 參考文獻47-54
• 致謝54-55
• 作者簡介55-57
• 導(dǎo)師評閱表57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Frank GROSSE;Multiple Functions of Nuclear DNA Helicase Ⅱ (RNA Helicase A) in Nucleic Acid Metabolism[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年03期

本文編號：672339