本文關(guān)鍵詞：卡介苗初免-DNA疫苗加強免疫策略的抗結(jié)核保護效果研究

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【摘要】：目的制備表達免疫優(yōu)勢抗原Ag85A的DNA疫苗,以其加強卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)初免的作用,并評價其抗結(jié)核(Tuberculosis, TB)的作用；同時分析疫苗接種后誘導的T細胞應答,并探討其與免疫保護的關(guān)系。 方法以真核表達載體pVAXI重組表達分枝桿菌抗原Ag85A,制備不含內(nèi)毒素的DNA疫苗Ag85A DNA。分別以PBS、BCG、BCG-Ag85A DNA(BCG初免-Ag85A DNA加強)、Ag85A DNA免疫小鼠,在免疫后8周進行結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)攻擊感染。感染后第1周和第5周,分別計數(shù)感染小鼠脾和肺內(nèi)的荷菌量,同時分析其肺和脾組織勻漿中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12、IL-4、IL-6、IL-10和TGF-β等細胞因子的表達,并對第5周小鼠的脾和肺進行病理學檢查和免疫組化分析,以評價該免疫策略對小鼠的抗結(jié)核保護作用。免疫后第8周,分別制備小鼠的肺和脾單細胞懸液,ELISPOT分析抗原特異的IFN-γ的分泌,流式細胞術(shù)分析T淋巴細胞Mtb特異的IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌及其CD44、CCR7、CD62L的表達,以評價該免疫策略的免疫原性并分析其與免疫保護效果之間的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果Ag85A基因成功插入pVAXI質(zhì)粒,測序結(jié)果與GenBank公布的完全一致。免疫小鼠攻擊后第1周,肺CFU(colony forming unit,菌落形成單位)計數(shù)各組問沒有顯著差異,脾內(nèi)尚不能檢測到Mtb的存在；攻擊后第5周,BCG-Ag85A DNA組脾和肺內(nèi)的CFU均最低,BCG組與PBS組相比亦有顯著的下降,但Ag85A DNA組與PBS組、BCG組相比均無顯著的統(tǒng)計學差異。病理學檢查BCG-Ag85A DNA組的病理損害也最輕。感染后第1周細胞因子的表達肺和脾幾乎都沒有統(tǒng)計學差異,第5周IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-10、TGF-β均為Ag85A DNA組最高,BCG組次之,BCG-Ag85ADNA組最低,PBS組與BCG-Ag85A DNA組相差不大,其他因子組間差異較小。免疫后第8周(未感染)的小鼠CD4T細胞反應的評價發(fā)現(xiàn)：PPD特異的IFN-y分泌細胞BCG組和BCG-Ag85A DNA組比PBS和Ag85A DNA多,但兩者間無明顯差異；Ag85A特異的IFN-y分泌細胞BCG-Ag85A DNA組則僅比PBS組高。流式細胞術(shù)分析單個細胞水平的IFN-γ、TNF-α及IL-2的表達,BCG-Ag85A DNA免疫小鼠能產(chǎn)生較高頻率的IL-2+、IL-2+TNF-α+、IFN-y+IL-2+以及IFN-y+TNF-a+IL-2+多功能CD4T細胞(p0.05)；BCG免疫誘導出更多的IFN-y+和IFN-γ+TNF-a+CD4T細胞；而Ag85ADNA單獨免疫誘導的Thl型CD4T細胞反應則較低。分析這些細胞的校正平均熒光強度值(intergrated mean fluorescence intensities, iMFI)發(fā)現(xiàn)BCG-Ag85A DNA組IL-2的iMFI值最高。所有的細胞因子分泌細胞均為CD44high; TNF-a分泌細胞幾乎都為CD62Lhigh, IFN-γ和IL-2分泌細胞的CD62L表達則有高有低,除了少量TNF-a分泌細胞外所有的細胞因子分泌細胞均為CCR7low。此外,BCG-Ag85A DNA組誘導的CD8T細胞反應也較強。 結(jié)論BCG初免-Ag85A DNA加強免疫策略可以顯著提供小鼠較BCG強的保護作用,表現(xiàn)為CFU下降病理損害減輕；同時可誘導出更強的CD4和CD8T細胞反應,IFN-y+TNF-a+IL-2+多功能CD4T細胞、IL-2分泌細胞及其分泌量均增加,因此能提供更好的保護；雖然Ag85A DNA加強可以誘導出更多的多功能T細胞和IL-2的分泌,但不能彌補BCG誘導TcM不足的缺陷。
【關(guān)鍵詞】：分枝桿菌 結(jié)核 DNA疫苗 BCG 免疫保護 免疫原性 多功能T細胞 IL-2 中央記憶T細胞
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8-10
• 一、Ag85A DNA疫苗的構(gòu)建和制備10-16
• 引言10
• 材料與試劑10-11
• 方法11-14
• 結(jié)果14
• 討論14-16
• 二、BCG初免-Ag85A DNA加強免疫策略的保護效果評價16-37
• 引言16
• 材料與方法16-21
• 結(jié)果21-33
• 討論33-37
• 三、BCG初免-Ag85A DNA加強免疫策略的免疫原性分析37-51
• 引言37
• 材料與方法37-40
• 結(jié)果40-46
• 討論46-51
• 參考文獻51-55
• 論文總結(jié)及創(chuàng)新點55-56
• 綜述56-63
• 參考文獻60-63
• 附錄63-64
• 致謝64-65

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本文編號：668922