本文關(guān)鍵詞：人類PIF1解螺旋酶的功能研究

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【摘要】：目的：PIF1基因被普遍認(rèn)為是輻射敏感型的基因，通過研究PIF1基因參與電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，來探討PIF1基因參與DNA損傷修復(fù)的分子機(jī)制。利用RNA干擾技術(shù)“敲低”PIF1全長(zhǎng)基因，進(jìn)一步的研究PIF1解螺旋酶的生理功能。構(gòu)建三種重組質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中來篩壓穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)的細(xì)胞系，用于對(duì)PIF1基因的更深入的研究。 方法：對(duì)培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞進(jìn)行不同劑量的γ射線照射，用Western blot和Real-Time PCR來檢測(cè)PIF1基因的表達(dá)量的變化，從變化中來了解和研究PIF1基因在DNA損傷修復(fù)中可能存在的功能。利用RNA干擾技術(shù)“沉默”PIF1全長(zhǎng)基因，通過Western blot和Real-Time PCR來檢測(cè)敲低細(xì)胞PIF1基因的敲低效果。觀察敲低的細(xì)胞系與野生型細(xì)胞系在生長(zhǎng)狀態(tài)上的差異.對(duì)敲低的細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量的γ射線照射，通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)了解細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期，克隆形成率等實(shí)驗(yàn)來觀察敲低細(xì)胞株與野生型細(xì)胞株在γ射線照射前后細(xì)胞的生存能力、DNA損傷修復(fù)情況及細(xì)胞周期變化情況。從pCR2.1-TOPO-PIF1原始質(zhì)粒中，利用PCR方法擴(kuò)增目的基因PIF1、PIF1N及PIF1C，將目的基因和目的載體pcDNA3.1（-）分別酶切定向連接，構(gòu)建出三種重組質(zhì)�！綪cDNA3.1（-）-PIF1、PcDNA3.1（-）-PIF1N、PcDNA3.1（-）-PIF1C】。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將這三種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，篩壓穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)的細(xì)胞系。 結(jié)果：1. HeLa細(xì)胞經(jīng)不同劑量的γ射線處理后通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PIF1蛋白表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)有先降低后升高的趨勢(shì)，用Real-Time PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PIF1基因在mRNA水平上也出現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)有先降低后升高的趨勢(shì)。2.通過Western blot和Real-Time PCR的方法檢測(cè)出敲低的細(xì)胞系與對(duì)照細(xì)胞相比較在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上都有不同程度的敲低現(xiàn)象。對(duì)敲低的細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量的γ射線照射處理后，活細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)Sh-PIF1-Hela敲低細(xì)胞比Sh-NC-Hela對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度要慢很多且細(xì)胞凋亡增加�？寺⌒纬陕蕦�(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞照射劑量的增加，細(xì)胞的增殖能力降低，，形成克隆數(shù)減少，敲低細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞的生存能力降低。流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)敲低細(xì)胞G2/M期阻滯明顯延長(zhǎng)。3.成功構(gòu)建出三種重組質(zhì)粒，并對(duì)其轉(zhuǎn)染的三種過表達(dá)的細(xì)胞系，通過Western blot法并沒有檢測(cè)出PIF1蛋白表達(dá)量的升高，但用Real-TimePCR的方法測(cè)出PcDNA3.1-PIF1全長(zhǎng)和PcDNA3.1-PIF1C端的mRNA相對(duì)表達(dá)量都有一定程度的增加，而PcDNA3.1-PIF1N端的mRNA的相對(duì)表達(dá)量并沒有增加。是否構(gòu)建出穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系有賴于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 結(jié)論1. PIF1基因具有輻射敏感性，與DNA損傷修復(fù)相關(guān)。2.成功的構(gòu)建出穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低的細(xì)胞系（Sh-PIF1-Hela）。發(fā)現(xiàn)PIF1基因與凋亡密切相關(guān)。3.成功的構(gòu)建出三種重組質(zhì)粒。
【關(guān)鍵詞】：PIF1 敲低細(xì)胞系 重組質(zhì)粒 過表達(dá)細(xì)胞系 DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 目錄5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 主要英文縮略語索引9-10
• 前言10-14
• 材料與方法14-28
• 1 材料14-17
• 2 方法17-27
• 3 統(tǒng)計(jì)分析27-28
• 結(jié)果28-40
• 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 文獻(xiàn)綜述46-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53-54
• 作者簡(jiǎn)介54-55
• 導(dǎo)師審閱表55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 王攀;趙德根;徐濤;顧永清;;人PIF1全長(zhǎng)基因及其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];中華實(shí)用診斷與治療雜志;2012年05期

2 劉元寧;常亞萍;李?yuàn)?張浩;田明堯;;針對(duì)H1N1病毒的多特征siRNA設(shè)計(jì)[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版);2010年03期

3 鞠吉雨;李在連;;RNA干擾與腫瘤基因治療[J];食品與藥品;2009年01期

本文編號(hào)：663724