發(fā)布時間：2017-08-09 05:14

  本文關(guān)鍵詞：消減免疫法篩選HPV型間雜合顆粒特異單克隆抗體及其表位研究

  更多相關(guān)文章： 人乳頭瘤病毒 型間雜合病毒樣顆粒 消減免疫 表位 分子模擬

【摘要】：人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的持續(xù)感染被證實(shí)是誘發(fā)女性宮頸癌的主要原因。世界范圍內(nèi),每年由HPV感染所致癌癥病例56萬例,約占全球全部癌癥新發(fā)病例的5%,死亡人數(shù)約20萬；在中國,每年約有10萬的婦女因HPV感染而導(dǎo)致宮頸癌,死亡病例約3萬。宮頸癌是繼乳腺癌之后嚴(yán)重威脅婦女健康的第二大疾病。與宮頸癌密切相關(guān)的高危型HPV有15種,要有效控制宮頸癌就必須有預(yù)防這15種型別HPV感染的疫苗。目前上市的2種疫苗只能預(yù)防HPV16和HPV18這兩種高危型的感染,保護(hù)率約占70%。因此,開發(fā)多價預(yù)防疫苗具有重大意義,同時也面臨巨大的挑戰(zhàn)。 本文在實(shí)驗室前期的研究基礎(chǔ)上,通過HPV16L1的C175和HPV52L1的C428位點(diǎn)突變,獲得兩種突變蛋白,混合組裝成均一的、與野生型VLP形態(tài)相似的雜合病毒樣顆粒(Virus Like Particle, VLP)。通過免疫原性考察,相同劑量的雜合VLP與野生型VLP所誘導(dǎo)的抗體水平相當(dāng),表明雜合VLP有作為廣譜HPV疫苗的潛力。由于雜合VLP兩個相鄰五聚體之間只能形成一個二硫鍵,在空間結(jié)構(gòu)上必然與野生型VLP不同,因此,雜合VLP有可能會產(chǎn)生新的功能表位,甚至可能產(chǎn)生新的廣譜表位。因此,篩選出針對雜合VLP特異反應(yīng)的單抗,同時通過該抗體分析雜合VLP相對于野生型VLP所產(chǎn)生的新表位具有重要意義。 本研究首先通過單克隆抗體篩選獲得了針對于雜合VLP特異反應(yīng)的單抗。在常規(guī)的免疫方法中,HPV雜合VLP的免疫血清抗體滴度與兩種野生型免疫的抗體滴度相當(dāng),篩選獲得的抗體差異性不大,且沒有針對雜合VLP新表位的單抗。因此本研究采用環(huán)磷酰胺消減免疫法,環(huán)磷酰胺可以抑制非目的抗原的免疫原性,提高免疫系統(tǒng)對目的抗原的應(yīng)答。本文針對HPV抗原的免疫進(jìn)行一系列摸索,最后建立的消減免疫方案是：耐受階段和免疫階段均不使用佐劑,抗原劑量為20μg,腹腔注射,環(huán)磷酰胺劑量為100mg/kg。對消減次數(shù)的研究表明,耐受次數(shù)不影響免疫抑制的持久性,停止環(huán)磷酰胺處理后,免疫抑制狀態(tài)可以維持4周。 本研究中,先使小鼠免疫系統(tǒng)對HPV16和HPV52野生型VLP的免疫無應(yīng)答,再以雜合VLP免疫小鼠,使少量的五聚體雜合特異的表位免疫應(yīng)答得到加強(qiáng),提高特異抗體的陽性率,減少篩選工作量。篩選獲得的抗體中,有2株抗體對雜合VLP特異,4株抗體對雜合VLP和野生型VLP的反應(yīng)差異性在10倍以上。證實(shí)了環(huán)磷酰胺消減免疫法可以有效地制備差異性抗體。 我們接著利用分子模擬方法,對以上抗體識別的表位進(jìn)行分析。選取雜合VLP的特異性抗體2B3,分別對抗體可變區(qū)和HPV16/52相鄰五聚體進(jìn)行同源模建和分子對接,預(yù)測出2B3與雜合VLP的相互作用區(qū)域在兩個五聚體之間,關(guān)鍵氨基酸是HPV16五聚體的Ser170和Lys439, HPV52五聚體的Asn240、Ser255、 Glu378、Lys382和Glu469。 綜上所述,本研究通過對消減免疫方案的研究,建立了以HPV為抗原的消減免疫方案,由此篩選獲得了雜合VLP特異性抗體和與野生型VLP具有較大差異性的抗體。利用生物信息學(xué)分子對接技術(shù),進(jìn)一步研究了特異性抗體識別的雜合VLP的特異表位。本研究獲得的雜合VLP特異表位信息,對于了解HPV L1蛋白的分子進(jìn)化,中和表位型別的特異性,雜合VLP組裝的機(jī)制以及開發(fā)基于雜合VLP的HPV廣譜疫苗具有重要的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：人乳頭瘤病毒 型間雜合病毒樣顆粒 消減免疫 表位 分子模擬
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞8-15
• 第一章 前言15-46
• 1. HPV簡介15-27
• 1.1 HPV基因組結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2 HPV的組裝16-17
• 1.3 病毒的感染途徑和傳播方式17-18
• 1.4 人乳頭瘤病毒的分類18-20
• 1.5 HPV的致病機(jī)制20-22
• 1.6 HPV的流行病學(xué)22-24
• 1.7 HPV的免疫24-27
• 2. HPV疫苗的研究27-33
• 2.1 預(yù)防性疫苗的研究27-31
• 2.2 治療性疫苗的研究31-33
• 3. 消減免疫的種類和應(yīng)用33-38
• 3.1 高區(qū)帶耐受消減免疫法33-34
• 3.2 新生期耐受消減免疫法34-36
• 3.3 藥物介導(dǎo)耐受消減免疫法36-38
• 4. 抗原表位的研究方法38-44
• 4.1 氨基酸替換和突變技術(shù)39
• 4.2 肽掃描技術(shù)39
• 4.3 生物信息學(xué)工具預(yù)測分析39-41
• 4.4 免疫復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析41-43
• 4.5 其他抗原表位研究方法43-44
• 5. 本研究的思路、目的和意義44-46
• 第二章 材料與方法46-73
• 1 儀器46-47
• 2 主要耗材47-48
• 3 主要試劑與實(shí)驗動物48-54
• 3.1 菌株、質(zhì)粒、酶和軟件48
• 3.2 單克隆抗體、細(xì)胞株及實(shí)驗動物48-49
• 3.3 其它試劑49
• 3.4 常見溶液及培養(yǎng)基的配制49-54
• 4 方法54-59
• 4.1 分子生物學(xué)實(shí)驗方法54-57
• 4.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定方法57-59
• 5 小鼠免疫及免疫評價實(shí)驗方法59-73
• 5.1 小鼠常規(guī)免疫59-60
• 5.2 小鼠消減免疫60
• 5.3 融合雜交瘤的篩選60-63
• 5.4 雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)63-64
• 5.5 單克隆抗體的制備及性質(zhì)鑒定64-68
• 5.6 單抗的表位鑒定68-73
• 第三章 結(jié)果與分析73-105
• 1. 消減免疫方案的研究73-87
• 1.1 小鼠免疫原的制備73-76
• 1.2 HPV雜合VLP免疫原性考察76-78
• 1.3 消減免疫耐受方案研究78-84
• 1.4 消減次數(shù)對耐受持久性的影響84-87
• 1.5 第一部分小結(jié)87
• 2. HPV雜合顆粒單克隆抗體的篩選及性質(zhì)鑒定87-95
• 2.1 單抗細(xì)胞株的篩選及穩(wěn)定單克隆細(xì)胞株的獲得87-88
• 2.2 單抗基本性質(zhì)鑒定88-94
• 2.3 第二部分小結(jié)94-95
• 3. HPV雜合VLP表位的預(yù)測95-105
• 3.1 單抗2B3可變區(qū)同源模建95-96
• 3.2 HPV雜合VLP同源模建96-98
• 3.3 Ramachandran plot評估98-99
• 3.4 Profile-3D分析99-100
• 3.5 單抗2B3-Fab與2個五聚體的分子對接100
• 3.6 對接結(jié)果分子間氫鍵分析100-101
• 3.7 對接結(jié)果溶劑可及表面分析101-103
• 3.8 單抗2B3識別表位的預(yù)測103-104
• 3.9 第三部分小結(jié)104-105
• 第四章 討論105-113
• 1. 消減免疫方案的摸索105-108
• 1.1 環(huán)磷酰胺作用原理105
• 1.2 佐劑使用的分析105-106
• 1.3 耐受原劑量的分析106
• 1.4 環(huán)磷酰胺劑量的分析106-107
• 1.5 消減次數(shù)的分析107
• 1.6 消減免疫效果評價107-108
• 2. HPV雜合VLP的結(jié)構(gòu)108-109
• 3. HPV雜合VLP表位的研究109-111
• 4. HPV雜合VLP在疫苗中的應(yīng)用111-113
• 小結(jié)與展望113-114
• 參考文獻(xiàn)114-124
• 致謝124-125
• 附錄125

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 任正忠,褚小玲,狄梅,張紅,朱宇,戴凌,祁雅慧,殷紅,赫翠珍,姚慶英,高天祥;采用PCR技術(shù)對CO_2激光治療尖銳濕疣煙霧中HPV，

本文編號：643659