本文關(guān)鍵詞：單細胞檢測SKOV3細胞轉(zhuǎn)染端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的表達及在監(jiān)測體外培養(yǎng)胚胎細胞中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 基因克隆 慢病毒 hTERT 端粒酶 單細胞 PCR hTERT 流式細胞術(shù) 單細胞 RT-PCR 應(yīng)用

【摘要】：目的：構(gòu)建攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的慢病毒表達載體,檢測hTERT基因在SKOV3細胞中的表達。方法：通過基因克隆構(gòu)建攜帶目的基因hTERT的重組慢病毒表達載體LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT,酶切、DNA測序驗證插入片段hTERT的準確性。慢病毒載體、包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞,超速離心沉淀法濃縮病毒上清,有限稀釋法測定病毒滴度。將重組慢病毒感染SKOV3細胞(SKOV3h),另外設(shè)立慢病毒空載體感染組(SKOV3b)和無處理組(SKOV3)為對照組,顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、PCR驗證hTERT mRNA表達、Western blot驗證hTERT蛋白表達。結(jié)果：重組慢病毒LV4-pGLV-EFla-EGFP-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞能產(chǎn)生重組病毒;目的基因hTERT能被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細胞并穩(wěn)定表達,熒光顯微鏡下可直接觀察到GFP; PCR、Western blot檢測感染后的SKOV3細胞,發(fā)現(xiàn)hTERT基因mRNA、蛋白表達均增強。結(jié)論：成功構(gòu)建了慢病毒表達載體LV4-pGLV-EFla-EGFP-hTERT,其能將外源hTERT基因?qū)隨KOV3細胞并使其長久表達,為永生化研究奠定了科研基礎(chǔ)。 目的：初步建立單細胞PCR檢測基因表達的方法,探討通過該方法檢測SKOV3細胞和體外培養(yǎng)胚胎細胞hTERT基因mRNA的表達。方法：1.通過細胞數(shù)目、模板、引物等條件優(yōu)化建立最佳的單細胞PCR檢測基因表達的方法。2.實驗分為三組,即通過慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定高表達hTERT蛋白的細胞株(SKOV3h),空載體感染組(SKOV3b)和未處理組(SKOV3),通過優(yōu)化的方法PCR檢測三組細胞hTERT基因mRNA的表達。3.實時PCR檢測單個卵裂球hTERT基因的表達。結(jié)果：初步摸索的細胞數(shù)在50個以內(nèi),且隨著細胞數(shù)目的增多Ct (Cycle threshold)值逐漸增大(P0.05),最佳細胞數(shù)目為5個；模板3μL,引物0.2μL時PCR所得結(jié)果最佳；按最佳單細胞PCR條件測得SKOV3h組hTERT基因mRNA表達最高,SKOV3b組次之,SKOV3組表達最低(P0.05)；單個卵裂球可以有效檢測到hTERT基因mRNA表達。結(jié)論：SKOV3細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT基因后可促進該基因的mRNA表達,提示單細胞檢測基因表達有一定的靈敏度；單卵裂球檢測到基因表達為利用單細胞單基因遺傳學(xué)診斷及腫瘤學(xué)研究提供基礎(chǔ)。 單細胞PCR出現(xiàn)于上世紀80年代后期,開創(chuàng)了單細胞基因表達的先河,它為在生命的基本單位——單細胞水平上進行產(chǎn)前診斷、基因表達與DNA測序等領(lǐng)域的研究提供了簡便又快捷的方法。二十多年來,該技術(shù)不斷改進,從最初的神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)展到免疫研究、胚胎移植等領(lǐng)域。隨著時代的進步,單細胞PCR在生命科學(xué)研究中將發(fā)揮更大的作用。
【關(guān)鍵詞】：基因克隆 慢病毒 hTERT 端粒酶 單細胞 PCR hTERT 流式細胞術(shù) 單細胞 RT-PCR 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 英文縮略詞6-8
• 摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 第一章 慢病毒轉(zhuǎn)染檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT在SKOV3中的表達17-73
• 1. 材料18-24
• 1.1 質(zhì)粒、菌株、細胞18-19
• 1.2 主要設(shè)備及儀器19-20
• 1.3 主要試劑20-21
• 1.4 主要試劑配制21-23
• 1.5 引物設(shè)計23-24
• 2. 方法24-45
• 2.1 pGLV-EF1a-EGFP-hTERT慢病毒表達載體的構(gòu)建24-29
• 2.2 攜帶hTERT基因重組慢病毒的包裝、濃縮、感染29-34
• 2.3 重組慢病毒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT在靶細胞中的表達34-44
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理44-45
• 3. 結(jié)果45-65
• 3.1 重組慢病毒質(zhì)粒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT的鑒定45-60
• 3.2 包裝細胞293T轉(zhuǎn)導(dǎo)pGLV-EF1a-EGFP-hTERT后GFP的表達60
• 3.3 病毒滴度測定60-61
• 3.4 重組慢病毒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT感染卵巢癌SKOV3細胞后GFP的表達61-62
• 3.5 重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞前后端粒酶基因hTERTmRNA的表達62-63
• 3.6 BCA法測定蛋白濃度63
• 3.7 重組慢病毒感染SKOV3細胞后hTERT蛋白表達情況63-65
• 4. 討論65-70
• 參考文獻70-73
• 第二章 單細胞PCR檢測細胞中端粒酶hTERT基因表達方法的建立73-91
• 1. 材料74-76
• 1.1 細胞來源74
• 1.2 試劑與儀器74-76
• 1.3 引物設(shè)計與合成76
• 2. 方法76-81
• 2.1 細胞培養(yǎng)76-77
• 2.2 單細胞PCR77-80
• 2.3 單卵裂球?qū)崟rPCR80-81
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理81
• 3. 結(jié)果81-86
• 3.1 細胞數(shù)目的確定81-82
• 3.2 引物與cDNA含量的確定82-83
• 3.3 兩步法所得結(jié)果83-84
• 3.4 一步法所得結(jié)果84
• 3.5 hTERT基因mRNA表達分析84-85
• 3.6 單卵裂球PCR體系優(yōu)化85-86
• 3.7 單卵裂球PCR結(jié)果86
• 4. 討論86-89
• 參考文獻89-91
• 綜述 單細胞RT-PCR技術(shù)應(yīng)用進展91-110
• 1. 單細胞RT-PCR技術(shù)研究特點91-98
• 1.1 單細胞的獲得93-95
• 1.2 單細胞的裂解95-96
• 1.3 單細胞RT-PCR擴增96-98
• 2. 單細胞RT-PCR技術(shù)的應(yīng)用98-102
• 2.1 在基因表達方面的應(yīng)用98-99
• 2.2 在植入前基因診斷方面的應(yīng)用99-101
• 2.3 在離子通道及受體方面的應(yīng)用101-102
• 3. 單細胞RT-PCR的未來發(fā)展前景102-104
• 參考文獻104-110
• 致謝110-112
• 攻讀學(xué)位期間參與的課題及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文112

【參考文獻】

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本文編號：636373