發(fā)布時間：2017-08-06 06:06

  本文關(guān)鍵詞：TGF-β1聯(lián)合hUCMSCs移植對SUI模型鼠尿道周圍結(jié)締組織中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin表達的影響

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【摘要】：研究目的： 1.建立從足月剖宮產(chǎn)孕婦臍帶分離間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、體外傳代培養(yǎng)擴增的方法，研究其生物學特征，為后續(xù)實驗提供細胞源。 2.培養(yǎng)基中添加TGF-β1誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSCs）定向分化為成纖維細胞（fibroblast），為進一步實驗奠定基礎(chǔ)。 3.通過模擬人類妊娠分娩、難產(chǎn)、產(chǎn)傷、卵巢去勢建立SD大鼠SUI的動物模型，將外源性TGF-β1聯(lián)合hUCMSCs注射于尿道周圍，根據(jù)尿動力學、噴嚏實驗、尿道及膀胱組織形態(tài)學和彈性纖維的改變，觀察細胞移植治療對尿道及其周圍組織和膀胱中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin表達的影響，為SUI的治療提供依據(jù)。 方法： 1．無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)的健康新生兒近臍部臍帶，應(yīng)用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)。 2．應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表面標志物；光學顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學特征；CCK8法檢測細胞的增殖能力并繪制生長曲線；體外誘導(dǎo)其向成脂細胞和成骨細胞分化來鑒定其多向分化能力。 3.制備細胞爬片，實驗組加TGF-β1（5ng/ml），對照組正常培養(yǎng)，誘導(dǎo)7天后免疫組化鑒定波形蛋白（Vimentin）、I型膠原的表達。 4.SUI動物模型的建立：①實驗組：SD孕鼠分娩后2小時內(nèi)麻醉，將14Fr弗萊氏導(dǎo)尿管插入陰道約2-3cm并固定，氣囊內(nèi)注入5ml生理鹽水，維持此狀態(tài)4h；2周后行雙側(cè)卵巢剔除術(shù)，常規(guī)飼養(yǎng)。②陽性對照組：SD孕鼠分娩后2小時內(nèi)麻醉，將14Fr弗萊氏導(dǎo)尿管插入陰道2-3cm并維持此狀態(tài)4h，常規(guī)飼養(yǎng)。③陰性對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，未予特殊處理。全部實驗SD大鼠均用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)進行尿動力學檢測，再行噴嚏實驗來驗證大鼠SUI模型建立是否成功。 5.將SUI模型鼠分為3組:一組注射生理鹽水，一組注射hUCMSCs，另一組注射TGF-β1聯(lián)合hUCMSCs，常規(guī)飼養(yǎng)6周后行尿動力學檢測和噴嚏實驗。 6.處死大鼠，取材于尿道及其周圍組織和膀胱，經(jīng)過HE、彈力纖維染色觀察尿道及其周圍組織和膀胱的形態(tài)學變化以及彈性纖維的變化情況；免疫組化、RT-PCR檢測組織中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的變化。 結(jié)果： 1.采用組織塊貼壁法在7-12天開始爬出細胞，3周后可首次傳代獲得原代細胞，細胞呈長梭形、成纖維細胞樣，漩渦狀生長，傳代后生長速度明顯增快，細胞形態(tài)更為均勻一致；細胞生長曲線表明細胞從第3天起進入對數(shù)生長期；培養(yǎng)的第3代細胞高表達CD29、CD44、CD90、CD105，而造血細胞表面標志物CD45、內(nèi)皮細胞標志物CD31、移植免疫排斥密切相關(guān)的表面標志物CD40和HLA-DR均極低表達；體外實驗證實本實驗培養(yǎng)的細胞能被誘導(dǎo)為成脂細胞和成骨細胞，說明所培養(yǎng)的細胞是間充質(zhì)干細胞。 2.通過鑒定細胞中I型膠原、Vimentin的表達，證明體外實驗中TGF-β1能誘導(dǎo)hUCMSCs向成纖維細胞分化，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。 3.模擬人類妊娠分娩、難產(chǎn)、產(chǎn)傷、卵巢去勢可以建立穩(wěn)定的SUI大鼠模型。實驗組、陽性對照組和陰性對照組大鼠的最大膀胱容量分別為1.67±0.37ml、2.94±0.12ml、3.1±0.27ml，漏尿點壓力分別為27.22±2.42mmHg、32.06±1.20mmHg、32.86±1.64mmHg。這2個指標實驗組均明顯低于兩對照組（P㩳0.05），兩對照組之間無統(tǒng)計學差異（P㧐0.05）。實驗組噴嚏實驗陽性率（76.2%）明顯高于對照組。尿道及其周圍組織和膀胱行HE染色形態(tài)學觀察：實驗組與陰性和陽性對照組相比，尿道肌層明顯變薄，部分肌層出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象；筋膜間結(jié)締組織成分增加，彈性纖維疏松，排列紊亂。實驗組膀胱組織HE染色可見肌層纖細并出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。彈力纖維染色提示實驗組大鼠尿道及其周圍結(jié)締組織彈性纖維彎曲度降低、細小、密度低，出現(xiàn)碎裂、崩解，排列無規(guī)則。膀胱組織彈力纖維染色在實驗組和對照組間無明顯差異，均僅可見血管周圍彈力纖維染色明顯。 4. SUI模型大鼠尿道周圍注射hUCMSCs：實驗組分為注射hUCMSCs、hUCMSCs+TGF-β1和生理鹽水組3組。hUCMSCs和hUCMSCs聯(lián)合TGF-β1移植組漏尿點壓力分別為30.63±1.49mmHg、31.05±2.13mmHg，最大膀胱容量分別為2.93±0.26ml、2.94±0.31ml均明顯高于生理鹽水組，生理鹽水注射治療前后無明顯統(tǒng)計學差異（P㧐0.05），hUCMSCs和hUCMSCs聯(lián)合TGF-β1移植組之間比較無統(tǒng)計學差異(P㧐0.05)，兩組噴嚏實驗陽性率低于生理鹽水注射組。尿道及其周圍組織和膀胱行HE染色形態(tài)學觀察：與生理鹽水注射組相比，hUCMSCs和hUCMSCs聯(lián)合TGF-β1組尿道肌層較增厚，，肌層和結(jié)締組織間聯(lián)系緊密。膀胱組織可見肌層明顯增厚、連續(xù)。彈力纖維染色顯示生理鹽水組尿道及其周圍結(jié)締組織中彈性纖維細小、密度低、排列不規(guī)則，而hUCMSCs和hUCMSCs聯(lián)合TGF-β1組彈性纖維明顯增加、排列整齊。膀胱組織彈力纖維染色不明顯。 5.尿道及其周圍組織和膀胱組織免疫組化檢測Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的變化情況：與注射生理鹽水組相比，hUCMSCs和hUCMSCs聯(lián)合TGF-β1組上述指標的表達均增加。RT-PCR結(jié)果顯示hUCMSCs聯(lián)合TGF-β1能增加Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的表達，差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1.應(yīng)用貼壁法可獲得較純的hUCMSCs，純化的hUCMSCs極低表達CD31、CD45、CD40、HLA-DＲ，強表達CD29、CD90、CD44、CD105。細胞在體外具有良好的擴增能力，性狀穩(wěn)定。通過鑒定細胞中I型膠原、Vimentin的表達，證明體外實驗中TGF-β1能誘導(dǎo)hUCMSCs向成纖維細胞，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。 2.根據(jù)SUI的發(fā)病機制，模擬人類妊娠、難產(chǎn)、產(chǎn)傷、卵巢去勢，通過尿道動力學指標、噴嚏實驗陽性率的比較可建立穩(wěn)定的SUI動物模型。HE染色和彈力纖維染色結(jié)果提示SUI模型鼠尿道及其周圍組織和膀胱組織中結(jié)構(gòu)不完整、彈性纖維出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。 3.對于本實驗中建立的SUI模型鼠，外源性TGF-β1聯(lián)合hUCMSCs可促進尿道及其周圍組織和膀胱組織中Loxl-1、Fibulin-5和Elastin的表達，通過修復(fù)彈性蛋白及其相關(guān)蛋白的缺陷而有效修復(fù)盆底連接組織，參與盆底結(jié)構(gòu)與功能的重塑過程。
【關(guān)鍵詞】：壓力性尿失禁 移植治療 臍帶間充質(zhì)干細胞 類賴氨酰氧化酶-1 Fibulin-5 彈性蛋白
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R711.59
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• Abstract7-11
• 目錄11-12
• 英文縮略詞12-14
• 前言14-18
• 第一章 臍帶間充質(zhì)干細胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定18-27
• 1 研究目的18
• 2 材料與方法18-23
• 3 實驗結(jié)果23-25
• 4 討論25-26
• 5 結(jié)論26-27
• 第二章 TGF β1 體外誘導(dǎo) hUCMSCs 分化為成纖維細胞的研究27-31
• 1 研究目的27
• 2 材料與方法27-28
• 3 實驗結(jié)果28-29
• 4 討論29-30
• 5 結(jié)論30-31
• 第三章 壓力性尿失禁大鼠動物模型的建立與鑒定31-39
• 1 研究目的31
• 2 材料與方法31-35
• 3 結(jié)果35-37
• 4 討論37-39
• 5 結(jié)論39
• 第四章 TGF β1 聯(lián)合 hUCMSCs 移植治療 SUI 模型鼠的實驗研究39-49
• 1 研究目的39-40
• 2 材料與方法40-42
• 3 結(jié)果42-47
• 4 討論47-49
• 5 結(jié)論49
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文49-50
• 致謝50-51
• 參考文獻51-56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 徐燕;李長虹;孟恒星;郝牧;邱錄貴;;人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學特性[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年32期

2 羅新;;女性盆底解剖結(jié)構(gòu)的新概念[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2006年01期

3 衛(wèi)向陽,劉維永,孫國成,歐陽輝,顧春虎,劉興光;犬骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離、誘導(dǎo)成纖維細胞的實驗研究[J];中華外科雜志;2005年18期

4 曾潔;劉娟;;壓力性尿失禁大鼠模型建立的研究[J];中國婦幼保健;2013年04期

本文編號：628628