本文關(guān)鍵詞：血清胸苷激酶單克隆抗體酶促化學(xué)發(fā)光試劑盒的研制

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【摘要】：目的研制特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測S-TK1(血清胸苷激酶)的單克隆抗體酶促化學(xué)發(fā)光試劑盒,以用于腫瘤早期檢測、預(yù)后和術(shù)后觀察及臨床療效監(jiān)控。 方法 一制備一對抗S-TK1單克隆抗體。 1抗體制備 A.設(shè)計(jì)并合成長度為15個(gè)氨基酸的S-TK1多肽,并與載體蛋白KLH耦聯(lián)制備多肽抗原； B.從Raji細(xì)胞提取物中純化獲得TK1抗原蛋白； C.抗S-TK1多肽抗原單克隆抗體的制備：常規(guī)免疫Balb/c小鼠,選擇血清抗體滴度較高的小鼠,取脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,用間接ELISA篩選獲得7株高親和力的抗S-TK1多肽的單克隆抗體,用于制備包被抗體； D.抗Raji細(xì)胞TK1抗原蛋白單克隆抗體的制備：方法如C,獲得3株高親和力的Raji細(xì)胞TK1抗原蛋白單克隆抗體,用于制備檢測抗體： 2.抗體鑒定通過對小鼠進(jìn)行小規(guī)模的腹水生產(chǎn),用蛋白質(zhì)A親合柱從每個(gè)腹水樣本中分離純化單克隆抗體,經(jīng)ELISA.免疫印跡法鑒定單克隆抗體效價(jià)、特異性、親和力以及種屬交叉反應(yīng),最后用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行抗體生產(chǎn)。二制作S-TK1酶促化學(xué)發(fā)光試劑盒 1抗體配對將7株高親和力的抗S-TK1多肽的單克隆抗體和3株高親和力的Raji細(xì)胞TK1抗原蛋白單克隆抗體配對,用ELISA進(jìn)行測試。 2標(biāo)記抗體使用辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標(biāo)記檢測抗體。 3化學(xué)發(fā)光法試劑盒工作參數(shù)的確定以魯米諾、對-2甲苯酚、吐溫-20為化學(xué)發(fā)光底物；經(jīng)比較確定包被抗體和檢測抗體的稀釋度；包被抗體即用稀釋的抗體加在酶標(biāo)板上4℃溫育過夜,之后洗滌,干燥過夜,用透明膠帶封存。 4試劑盒技術(shù)參數(shù)的測定即靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、特異性、相關(guān)性測定。 結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)得到靈敏度高的10株抗體,它們是Antip-1-1A9; Antip-1-3D3; Antip-1-4B5; Antip-1-4D3; Antip-1-4F7; Antip-2-2B7; Antip-2-8E11; Antir-1-6A7;Antir-1-9H5;Antir-2-7D6.通過對效價(jià)、特異性、親和力、種屬交叉反應(yīng)檢測均在較好范圍。經(jīng)過配對實(shí)驗(yàn)最終選定配對靈敏度最高的一對抗體,即包被抗體Antip-1-4D3和檢測抗體Antir-1-9H5,作為配對抗體。包被濃度為5μg/ml, HRP標(biāo)記的抗體稀釋度為1：1500。確定化學(xué)發(fā)光試劑盒的檢測正常范圍為≤2.0pM,陽性范圍為2.0pM。試劑盒技術(shù)參數(shù)的測定結(jié)果如下：靈敏度0.156PM、準(zhǔn)確度回收率95%和104%、精密度CV值批內(nèi)4.5%和5.7%,批間9.4%和9.0%、穩(wěn)定性5d內(nèi)穩(wěn)定、特異性與TG(甲狀腺球蛋白)交叉反應(yīng)率0.25%、相關(guān)性回歸方程Y=0.1235+0.9945X,相關(guān)系數(shù)r=0.9997(P0.01)。 結(jié)論通過本實(shí)驗(yàn)得到一種血清胸苷激酶1(S-TK1)單克隆抗體酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光診斷試劑盒,通過各項(xiàng)檢測試驗(yàn),證實(shí)該試劑盒具有較高靈敏度和特異性,且該試劑盒簡便易操作,有望成為癌癥早期診斷的廣譜性試劑盒。
【關(guān)鍵詞】：血清胸苷激酶1(S-TK1) 腫瘤標(biāo)志物 單克隆抗體 化學(xué)發(fā)光試劑盒 檢測方法
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、血清胸苷激酶單克隆抗體酶制備14-27
• 1.1 材料和方法14-18
• 1.1.1 材料14-15
• 1.1.2 方法15-18
• 1.2 結(jié)果18-25
• 1.2.1 單克隆抗體篩選結(jié)果18-22
• 1.2.2 抗體鑒定結(jié)果22-25
• 1.3 討論25-26
• 1.3.1 血清胸苷激酶升高或降低25
• 1.3.2 TK1結(jié)構(gòu)和序列的選擇25
• 1.3.3 雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體25-26
• 1.3.4 Raji細(xì)胞特點(diǎn)26
• 1.4 小結(jié)26-27
• 二、血清胸苷激酶單克隆抗體酶促化學(xué)發(fā)光試劑盒的制作27-34
• 2.1 材料與方法27-29
• 2.1.1 材料27
• 2.1.2 方法27-29
• 2.2 結(jié)果29-31
• 2.2.1 抗體配對結(jié)果29-30
• 2.2.2 試劑盒工作參數(shù)的確立與優(yōu)化30-31
• 2.2.3 試劑盒技術(shù)參數(shù)測定結(jié)果31
• 2.3 討論31-33
• 2.3.1 TK1的常見的檢測方法31
• 2.3.2 放射同位素法31
• 2.3.3 ELISA法31-32
• 2.3.4 免疫點(diǎn)印跡法32
• 2.3.5 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光點(diǎn)印跡法32
• 2.3.6 本實(shí)驗(yàn)研制的試劑盒采用的方法32
• 2.3.7 本方法的影響因素32-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 發(fā)表論文37-38
• 綜述38-47
• 胸苷激酶1的研究與檢測方法的進(jìn)展38-45
• 綜述參考文獻(xiàn)45-47
• 致謝47

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳曲波;劉瑞萍;黃惠;李強(qiáng);張健媛;鄭松柏;李倩s，

本文編號：623238