本文關(guān)鍵詞：郵致敏蛋白Pen a 1抗原表位多克隆抗體的制備及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 蝦致敏蛋白Pen a1 表位抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

【摘要】：蝦類等海產(chǎn)品因其營養(yǎng)、美味一直是人們鐘愛的美食，其消費(fèi)量及出口量均處于重要地位。但它也是引起食物過敏的重要過敏原之一，這不但對(duì)消費(fèi)者的身體健康及生命安全有巨大的威脅，同時(shí)也不利于我國國際貿(mào)易的健康發(fā)展。因此，開展蝦類過敏原的相關(guān)研究受到研究者的極大關(guān)注。隨著過敏原研究的逐步深入，人們對(duì)過敏原抗原表位的識(shí)別和鑒定技術(shù)越發(fā)成熟。抗原表位是過敏原引發(fā)過敏反應(yīng)的基礎(chǔ)，基于過敏原的抗原表位開展一系列的研究將具有重要的理論及實(shí)際意義。 本文以蝦中存在的最主要的一種致敏蛋白P en a1（tropomyosin）的抗原表位為研究對(duì)象，其研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1. Pen a1抗原表位多肽的合成。采用Fmoc法化學(xué)合成針對(duì)Pen a1抗原表位的5個(gè)多肽片段，并將多肽分別與載體蛋白KLH和BSA偶聯(lián)制得五5種人工免疫原及5種人工包被原。反向高效液相色譜檢測多肽合成純度分別為：85.97%、88.85%、92.76%、95.44%和88.00%，均達(dá)到免疫原純度要求。斑點(diǎn)免疫法驗(yàn)證合成多肽生物活性良好。采用Ellman試劑檢測多肽與載體蛋白的偶聯(lián)率，偶聯(lián)效果較好。 2. Pen a1抗原表位抗體的制備及鑒定。5種人工免疫原分別免疫新西蘭純種白兔，獲得五種多抗血清，其抗體效價(jià)均達(dá)到1.024106，較理想。分別以5種多肽為競爭物，進(jìn)行間接競爭ELISA（ic-ELISA），獲得對(duì)應(yīng)回歸方程，計(jì)算得其IC50分別為：0.1574μg mL~(-1)、0.4324μg mL~(-1)、0.2291μg mL~(-1)、0.1145μg mL~(-1)和0.3605μg mL~(-1)。 3. Pen a1表位抗體制備免疫親和柱及其效能測定。選擇特異性良好且抗血清獲得量較大的第5號(hào)表位多肽抗血清，抗血清經(jīng)辛酸-硫酸銨及特異性血清純化預(yù)裝柱純化后與溴化氰活化的瓊脂糖凝4B進(jìn)行偶聯(lián)，Bradford法測定其偶聯(lián)率為90.76%。ic-ELISA測定1mL偶聯(lián)介質(zhì)的吸附容量為2.84mg Pen a1，免疫親和柱的加標(biāo)回收率為89.6%-93.6%，親和柱使用壽命為4次。 4. Pen a1表位抗體用于食品中蝦致敏蛋白的快速檢測研究。選取市售的標(biāo)簽中標(biāo)注含有蝦肉成分和不含蝦肉成分的8種具有代表性的食品，利用Pen a1的第2個(gè)表位抗體對(duì)食品中是否含有蝦過敏成分進(jìn)行定性及定量判定，其中定性判定結(jié)果與標(biāo)簽一致，并且對(duì)于標(biāo)簽標(biāo)示不詳?shù)氖称�，也具有較好的識(shí)別性，同時(shí)還可大致估算出食品中所含的蝦過敏蛋白的含量。 5. Pen a1表位抗體用于檢測輻照對(duì)Pen a1免疫原性的影響。對(duì)提取純化的2mg/mL的Pen a1采用-射線進(jìn)行輻照處理，，輻照劑量為0、6.7kGy，利用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF MS測定，發(fā)現(xiàn)輻照后，36kD的Pen a1蛋白溶液中出現(xiàn)了約20kD、60kD以及40kD左右的新的條帶。Western Bolt驗(yàn)證了60kD附近的蛋白條帶也可被5個(gè)表位抗體識(shí)別，表明表位抗體在檢測的過程中具有較好的特異性。 綜上，本文嘗試了從致敏蛋白抗原表位出發(fā)，對(duì)表位對(duì)應(yīng)的多肽片段進(jìn)行合成、鑒定、偶聯(lián)和制備抗體，同時(shí)利用抗體進(jìn)行免疫親和柱的制備、食品中相應(yīng)致敏蛋白的檢測及檢測蛋白經(jīng)輻照處理后蛋白表位對(duì)應(yīng)的免疫原性的變化情況，為開發(fā)致敏蛋白的免疫親和技術(shù)、食品中致敏蛋白的檢測及加工處理方法對(duì)致敏蛋白脫敏機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蝦致敏蛋白Pen a1 表位抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 緒論13-24
• 1.1 食物過敏原概述13-16
• 1.1.1 食物過敏原的定義13
• 1.1.2 食物過敏原的種類13-15
• 1.1.3 食物過敏的發(fā)病機(jī)制15-16
• 1.2 致敏蛋白純化技術(shù)和食物過敏原檢測技術(shù)的研究現(xiàn)狀16-18
• 1.2.1 致敏蛋白純化技術(shù)的研究現(xiàn)狀16-17
• 1.2.2 食物過敏原檢測技術(shù)研究現(xiàn)狀17-18
• 1.3 食品加工對(duì)過敏原活性的影響18-20
• 1.3.1 物理法18-19
• 1.3.2 化學(xué)法19-20
• 1.3.3 生物法20
• 1.4 食物過敏原抗原表位概述20-22
• 1.4.1 食物過敏原抗原表位的定義20-21
• 1.4.2 食物過敏原抗原表位的種類21
• 1.4.3 食物過敏原抗原表位的鑒定研究進(jìn)展21-22
• 1.4.4 蝦過敏原抗原表位的研究進(jìn)展22
• 1.5 本研究的立題目的及意義22-23
• 1.6 本研究的研究內(nèi)容23-24
• 第二章 Pen a 1 表位多肽的設(shè)計(jì)合成24-31
• 2.1 儀器與試劑24-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 2.1.2 材料與試劑24
• 2.1.3 溶液配制24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-26
• 2.2.1 Pen a 1 表位多肽的設(shè)計(jì)25
• 2.2.2 多肽的合成及純度分析25
• 2.2.3 合成多肽的偶聯(lián)25-26
• 2.2.4 免疫斑點(diǎn)法分析合成多肽的生物活性26
• 2.3 結(jié)果與分析26-29
• 2.3.1 合成多肽的準(zhǔn)確度及純度分析26-28
• 2.3.2 合成多肽的偶聯(lián)結(jié)果測定28-29
• 2.3.3 合成多肽的生物活性初步驗(yàn)證29
• 2.4 討論29-30
• 2.5 本章小結(jié)30-31
• 第三章 Pen a 1 抗原表位抗體的制備及鑒定31-38
• 3.1 儀器與試劑31-32
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器31
• 3.1.2 材料與試劑31-32
• 3.1.3 溶液的配制32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 3.2.1 動(dòng)物免疫32-33
• 3.2.2 間接 ELISA 測定血清效價(jià)33-34
• 3.2.3 抗原抗體最佳工作濃度篩選34
• 3.2.4 多克隆抗體靈敏度的測定34
• 3.3 結(jié)果與分析34-37
• 3.3.1 兔血清效價(jià)測定34-35
• 3.3.2 抗原抗體最佳工作濃度確定35
• 3.3.3 多克隆抗體對(duì)多肽靈敏度的測定35-37
• 3.4 討論37
• 3.5 本章小結(jié)37-38
• 第四章 Pen a 1 表位抗體用于制備免疫親和柱的研究38-53
• 4.1 儀器與試劑38-41
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器38-39
• 4.1.2 材料與試劑39
• 4.1.3 溶液配制39-41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 4.2.1 蝦致敏蛋白 Pen a 1 提取、純化及鑒定41-42
• 4.2.2 Pen a 1 表位抗體的選擇與純化42-43
• 4.2.3 間接競爭 ELISA 檢測方法的建立43
• 4.2.4 免疫親和柱的制備43
• 4.2.5 免疫親和柱效能的測定43-44
• 4.3 結(jié)果與分析44-51
• 4.3.1 蝦致敏蛋白 Pen a 1 純化效果鑒定44-47
• 4.3.2 Pen a 1 表位抗體的篩選與純化結(jié)果47-48
• 4.3.3 間接競爭 ELISA 檢測方法的建立48
• 4.3.4 抗體與凝膠介質(zhì)的偶聯(lián)率的測定48-49
• 4.3.5 免疫親和柱效能的測定49-51
• 4.4 討論51
• 4.5 小結(jié)51-53
• 第五章 ：Pen a 1 表位抗體用于食品中蝦致敏蛋白的快速檢測53-57
• 5.1 儀器與試劑53-54
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器53
• 5.1.2 材料與試劑53-54
• 5.1.3 溶液配制54
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法54-55
• 5.2.0 樣品選擇54
• 5.2.1 樣品蛋白提取54
• 5.2.2 測試方法54-55
• 5.3 結(jié)果與分析55-56
• 5.3.1 多肽測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制55
• 5.3.2 樣品蝦過敏成分定性判定55-56
• 5.3.3 樣品蝦過敏成分含量計(jì)算56
• 5.4 討論56
• 5.5 本章小結(jié)56-57
• 第六章 ：表位抗體用于檢測輻照對(duì) Pen a 1 免疫原性的影響57-62
• 6.1 儀器與試劑57-58
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器57-58
• 6.1.2 材料與試劑58
• 6.1.3 溶液配制58
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 6.2.1 Pen a 1 蛋白的輻照處理58
• 6.2.2 輻照對(duì) Pen a 1 的分子量的影響測定58
• 6.2.3 輻照對(duì) Pen a 1 免疫原性的影響測定58-59
• 6.3 結(jié)果與分析59-61
• 6.3.1 輻照劑量確定59
• 6.3.2 輻照對(duì) Pen a 1 的分子量的影響59-60
• 6.3.3 輻照對(duì) Pen a 1 免疫原性的影響60-61
• 6.4 小結(jié)61-62
• 第七章 ：結(jié)論與展望62-63
• 7.1 結(jié)論62
• 7.2 展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69
• 作者簡歷69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：617465