本文關(guān)鍵詞：郵致敏蛋白Pen a 1抗原表位多克隆抗體的制備及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 蝦致敏蛋白Pen a1 表位抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗

【摘要】：蝦類等海產(chǎn)品因其營養(yǎng)、美味一直是人們鐘愛的美食，其消費量及出口量均處于重要地位。但它也是引起食物過敏的重要過敏原之一，這不但對消費者的身體健康及生命安全有巨大的威脅，同時也不利于我國國際貿(mào)易的健康發(fā)展。因此，開展蝦類過敏原的相關(guān)研究受到研究者的極大關(guān)注。隨著過敏原研究的逐步深入，人們對過敏原抗原表位的識別和鑒定技術(shù)越發(fā)成熟�？乖砦皇沁^敏原引發(fā)過敏反應(yīng)的基礎(chǔ)，基于過敏原的抗原表位開展一系列的研究將具有重要的理論及實際意義。 本文以蝦中存在的最主要的一種致敏蛋白P en a1（tropomyosin）的抗原表位為研究對象，其研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1. Pen a1抗原表位多肽的合成。采用Fmoc法化學合成針對Pen a1抗原表位的5個多肽片段，并將多肽分別與載體蛋白KLH和BSA偶聯(lián)制得五5種人工免疫原及5種人工包被原。反向高效液相色譜檢測多肽合成純度分別為：85.97%、88.85%、92.76%、95.44%和88.00%，均達到免疫原純度要求。斑點免疫法驗證合成多肽生物活性良好。采用Ellman試劑檢測多肽與載體蛋白的偶聯(lián)率，偶聯(lián)效果較好。 2. Pen a1抗原表位抗體的制備及鑒定。5種人工免疫原分別免疫新西蘭純種白兔，獲得五種多抗血清，其抗體效價均達到1.024106，較理想。分別以5種多肽為競爭物，進行間接競爭ELISA（ic-ELISA），獲得對應(yīng)回歸方程，計算得其IC50分別為：0.1574μg mL~(-1)、0.4324μg mL~(-1)、0.2291μg mL~(-1)、0.1145μg mL~(-1)和0.3605μg mL~(-1)。 3. Pen a1表位抗體制備免疫親和柱及其效能測定。選擇特異性良好且抗血清獲得量較大的第5號表位多肽抗血清，抗血清經(jīng)辛酸-硫酸銨及特異性血清純化預裝柱純化后與溴化氰活化的瓊脂糖凝4B進行偶聯(lián)，Bradford法測定其偶聯(lián)率為90.76%。ic-ELISA測定1mL偶聯(lián)介質(zhì)的吸附容量為2.84mg Pen a1，免疫親和柱的加標回收率為89.6%-93.6%，親和柱使用壽命為4次。 4. Pen a1表位抗體用于食品中蝦致敏蛋白的快速檢測研究。選取市售的標簽中標注含有蝦肉成分和不含蝦肉成分的8種具有代表性的食品，利用Pen a1的第2個表位抗體對食品中是否含有蝦過敏成分進行定性及定量判定，其中定性判定結(jié)果與標簽一致，并且對于標簽標示不詳?shù)氖称�，也具有較好的識別性，同時還可大致估算出食品中所含的蝦過敏蛋白的含量。 5. Pen a1表位抗體用于檢測輻照對Pen a1免疫原性的影響。對提取純化的2mg/mL的Pen a1采用-射線進行輻照處理，，輻照劑量為0、6.7kGy，利用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF MS測定，發(fā)現(xiàn)輻照后，36kD的Pen a1蛋白溶液中出現(xiàn)了約20kD、60kD以及40kD左右的新的條帶。Western Bolt驗證了60kD附近的蛋白條帶也可被5個表位抗體識別，表明表位抗體在檢測的過程中具有較好的特異性。 綜上，本文嘗試了從致敏蛋白抗原表位出發(fā)，對表位對應(yīng)的多肽片段進行合成、鑒定、偶聯(lián)和制備抗體，同時利用抗體進行免疫親和柱的制備、食品中相應(yīng)致敏蛋白的檢測及檢測蛋白經(jīng)輻照處理后蛋白表位對應(yīng)的免疫原性的變化情況，為開發(fā)致敏蛋白的免疫親和技術(shù)、食品中致敏蛋白的檢測及加工處理方法對致敏蛋白脫敏機理的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蝦致敏蛋白Pen a1 表位抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 緒論13-24
• 1.1 食物過敏原概述13-16
• 1.1.1 食物過敏原的定義13
• 1.1.2 食物過敏原的種類13-15
• 1.1.3 食物過敏的發(fā)病機制15-16
• 1.2 致敏蛋白純化技術(shù)和食物過敏原檢測技術(shù)的研究現(xiàn)狀16-18
• 1.2.1 致敏蛋白純化技術(shù)的研究現(xiàn)狀16-17
• 1.2.2 食物過敏原檢測技術(shù)研究現(xiàn)狀17-18
• 1.3 食品加工對過敏原活性的影響18-20
• 1.3.1 物理法18-19
• 1.3.2 化學法19-20
• 1.3.3 生物法20
• 1.4 食物過敏原抗原表位概述20-22
• 1.4.1 食物過敏原抗原表位的定義20-21
• 1.4.2 食物過敏原抗原表位的種類21
• 1.4.3 食物過敏原抗原表位的鑒定研究進展21-22
• 1.4.4 蝦過敏原抗原表位的研究進展22
• 1.5 本研究的立題目的及意義22-23
• 1.6 本研究的研究內(nèi)容23-24
• 第二章 Pen a 1 表位多肽的設(shè)計合成24-31
• 2.1 儀器與試劑24-25
• 2.1.1 實驗儀器24
• 2.1.2 材料與試劑24
• 2.1.3 溶液配制24-25
• 2.2 實驗方法25-26
• 2.2.1 Pen a 1 表位多肽的設(shè)計25
• 2.2.2 多肽的合成及純度分析25
• 2.2.3 合成多肽的偶聯(lián)25-26
• 2.2.4 免疫斑點法分析合成多肽的生物活性26
• 2.3 結(jié)果與分析26-29
• 2.3.1 合成多肽的準確度及純度分析26-28
• 2.3.2 合成多肽的偶聯(lián)結(jié)果測定28-29
• 2.3.3 合成多肽的生物活性初步驗證29
• 2.4 討論29-30
• 2.5 本章小結(jié)30-31
• 第三章 Pen a 1 抗原表位抗體的制備及鑒定31-38
• 3.1 儀器與試劑31-32
• 3.1.1 實驗儀器31
• 3.1.2 材料與試劑31-32
• 3.1.3 溶液的配制32
• 3.2 實驗方法32-34
• 3.2.1 動物免疫32-33
• 3.2.2 間接 ELISA 測定血清效價33-34
• 3.2.3 抗原抗體最佳工作濃度篩選34
• 3.2.4 多克隆抗體靈敏度的測定34
• 3.3 結(jié)果與分析34-37
• 3.3.1 兔血清效價測定34-35
• 3.3.2 抗原抗體最佳工作濃度確定35
• 3.3.3 多克隆抗體對多肽靈敏度的測定35-37
• 3.4 討論37
• 3.5 本章小結(jié)37-38
• 第四章 Pen a 1 表位抗體用于制備免疫親和柱的研究38-53
• 4.1 儀器與試劑38-41
• 4.1.1 實驗儀器38-39
• 4.1.2 材料與試劑39
• 4.1.3 溶液配制39-41
• 4.2 實驗方法41-44
• 4.2.1 蝦致敏蛋白 Pen a 1 提取、純化及鑒定41-42
• 4.2.2 Pen a 1 表位抗體的選擇與純化42-43
• 4.2.3 間接競爭 ELISA 檢測方法的建立43
• 4.2.4 免疫親和柱的制備43
• 4.2.5 免疫親和柱效能的測定43-44
• 4.3 結(jié)果與分析44-51
• 4.3.1 蝦致敏蛋白 Pen a 1 純化效果鑒定44-47
• 4.3.2 Pen a 1 表位抗體的篩選與純化結(jié)果47-48
• 4.3.3 間接競爭 ELISA 檢測方法的建立48
• 4.3.4 抗體與凝膠介質(zhì)的偶聯(lián)率的測定48-49
• 4.3.5 免疫親和柱效能的測定49-51
• 4.4 討論51
• 4.5 小結(jié)51-53
• 第五章 ：Pen a 1 表位抗體用于食品中蝦致敏蛋白的快速檢測53-57
• 5.1 儀器與試劑53-54
• 5.1.1 實驗儀器53
• 5.1.2 材料與試劑53-54
• 5.1.3 溶液配制54
• 5.2 實驗方法54-55
• 5.2.0 樣品選擇54
• 5.2.1 樣品蛋白提取54
• 5.2.2 測試方法54-55
• 5.3 結(jié)果與分析55-56
• 5.3.1 多肽測定標準曲線的繪制55
• 5.3.2 樣品蝦過敏成分定性判定55-56
• 5.3.3 樣品蝦過敏成分含量計算56
• 5.4 討論56
• 5.5 本章小結(jié)56-57
• 第六章 ：表位抗體用于檢測輻照對 Pen a 1 免疫原性的影響57-62
• 6.1 儀器與試劑57-58
• 6.1.1 實驗儀器57-58
• 6.1.2 材料與試劑58
• 6.1.3 溶液配制58
• 6.2 實驗方法58-59
• 6.2.1 Pen a 1 蛋白的輻照處理58
• 6.2.2 輻照對 Pen a 1 的分子量的影響測定58
• 6.2.3 輻照對 Pen a 1 免疫原性的影響測定58-59
• 6.3 結(jié)果與分析59-61
• 6.3.1 輻照劑量確定59
• 6.3.2 輻照對 Pen a 1 的分子量的影響59-60
• 6.3.3 輻照對 Pen a 1 免疫原性的影響60-61
• 6.4 小結(jié)61-62
• 第七章 ：結(jié)論與展望62-63
• 7.1 結(jié)論62
• 7.2 展望62-63
• 參考文獻63-68
• 致謝68-69
• 作者簡歷69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 睢珂;潘家榮;王磊;王志偉;趙杰;鄭月明;諸葛潔婧;潘文斌;;醚型菊酯類農(nóng)藥通用抗原的合成及鑒定[J];分析化學;2012年08期

2 董曉穎;高美須;潘家榮;張春紅;王志東;李淑榮;;不同處理方法對蝦過敏蛋白分子量及抗原性的影響[J];核農(nóng)學報;2010年03期

3 李洪利,黃P",周麗;親和層析技術(shù)在現(xiàn)代蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用及新發(fā)展[J];海洋湖沼通報;2005年03期

4 鄭禮娜;林洪;劉一璇;李鈺金;李振興;;不同熱加工方式對刀額新對蝦過敏原活性的影響[J];水產(chǎn)學報;2011年03期

5 劉一璇;林洪;吳麗莎;陳瑜;王國英;李振興;;加工方式對刀額新對蝦主要過敏原免疫原性的影響[J];水產(chǎn)學報;2011年06期

6 邢立靜,種康,許智宏,王銳,譚克輝;合成多肽制備的抗體用于蛋白質(zhì)免疫組織細胞化學定位研究[J];生物化學與生物物理進展;2004年02期

7 李欣,陳紅兵;過敏原在食品加工中的變化[J];食品工業(yè);2005年01期

8 張春紅;王爍;李淑榮;吳海文;;提取及加工方法對花生致敏蛋白的影響[J];食品工業(yè)科技;2008年11期

9 賈曉川;安奉凱;潘紅青;王碩;;免疫分析在食品安全檢測中的應(yīng)用[J];食品研究與開發(fā);2009年04期

10 張華;陳偉;張曉峰;周南;劉群英;湯魯宏;鄧超;;刀額新對蝦組織蛋白中變應(yīng)原組分的分析與純化[J];中國生物制品學雜志;2008年10期

本文編號：617465