本文關(guān)鍵詞：重組β防御素3載體的構(gòu)建及其抗菌活性初探

  更多相關(guān)文章： ELP-SPM表達(dá)系統(tǒng) HBD-3 抗菌活性 白念珠菌 金黃色葡萄球菌

【摘要】：防御素是近年來發(fā)現(xiàn)的人體抵抗病原微生物的重要物質(zhì)—抗菌肽中的一大類,大小約為3-5KDa,是一種富含半胱氨酸的陽離子短肽類物質(zhì),它在特異性免疫和非特異性免疫中都具有重要的作用,它可以拮抗包括G+菌、G-菌、真菌、病毒、原蟲等在內(nèi)的多種病原體且不易產(chǎn)生耐藥性。 現(xiàn)今抗生素的廣泛使用,產(chǎn)生的各種問題,如體內(nèi)藥物的殘留、過敏反應(yīng)、耐藥性,迫使人類急需開發(fā)一種新型抗菌物質(zhì),因此抗菌肽的研究開發(fā)利用成為一個(gè)熱點(diǎn)。防御素是抗菌肽家族中的一大類,為一種含有β-片層結(jié)構(gòu)的陽離子活性肽,人防御素類別中的人β防御素-3(Human beta-defensin-3, HBD-3)最初是在銀屑病患者的皮損組織提取物中發(fā)現(xiàn)的,且在皮膚、扁桃體、呼吸道、生殖道上皮細(xì)胞、成年人骨骼肌、心臟、胸腺、食道、口腔黏膜、氣管和胎盤均有不同程度的表達(dá),HBD-3由于其抗菌譜廣,鹽濃度對(duì)其影響相對(duì)小,對(duì)宿主細(xì)胞的毒性低,且對(duì)多重耐藥菌有效,因此具有較高的研究價(jià)值。 本研究根據(jù)大腸桿菌的偏好密碼子,人工設(shè)計(jì)并合成了HBD-3基因,克隆到原核表達(dá)載體pET30a-SPM-ELP中,獲得重組表達(dá)載體pET-30a-ELP-SPM-HBD-3.本實(shí)驗(yàn)所使用的彈性蛋白樣多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)介導(dǎo)的原核表達(dá)載體系統(tǒng),是目前最為成功的外源性蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。載體中的ELP是一類人工合成的生物大分子,由五肽重復(fù)序列單元VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly, Xaa可以是除Pro在外的任何一種氨基酸)。ELP具有溫度誘導(dǎo)的可逆變特性,即在高于某一特定相變溫度的溶液中呈現(xiàn)凝聚的狀態(tài),在低于這一溫度時(shí)為可溶的狀態(tài)。ELP融合蛋白也具有與ELP相似的性質(zhì),因此能通過此特性,用溫度控制和離心法來分離前體蛋白。自我剪接單元(self-processing module, SPM)為一具有自我剪切特性的標(biāo)簽的單元,在有Ca2+存在條件下可執(zhí)行自我剪切功能,可利用鈣離子切割液來切割獲取目的小蛋白。本研究利用其中彈性蛋白樣多肽(ELP)系統(tǒng)具有的溫度誘導(dǎo)反復(fù)相變特性,以低溫誘導(dǎo)法誘導(dǎo)重組菌表達(dá),在不同溫度進(jìn)行反復(fù)離心洗滌結(jié)合鹽離子的沉淀,獲得了融合蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE檢測證明能表達(dá)預(yù)期分子量大小的融合前體蛋白ELP-SPM-HBD3,再切割,獲得目的蛋白后,利用瓊脂擴(kuò)散法來測定其體外抗白念珠菌活性,通過瓊脂擴(kuò)散法,MIC測定及動(dòng)物模型來測定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)研究中重組表達(dá)載體所表達(dá)的HBD-3具有一定的抗白色念珠菌及金黃色葡萄球菌活性,其最小抑制金黃色葡萄球菌濃度為80μg/ml,且對(duì)金黃色葡萄球菌動(dòng)物感染模型也有一定的抗感染作用。 本實(shí)驗(yàn)方法中重組蛋白的分離、純化過程簡單,生產(chǎn)成本低,且表達(dá)出的HBD-3有一定的抗菌活性,故可為進(jìn)一步研究和開發(fā)HBD-3奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：ELP-SPM表達(dá)系統(tǒng) HBD-3 抗菌活性 白念珠菌 金黃色葡萄球菌
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 符號(hào)說明8-10
• 第一章：文獻(xiàn)綜述10-16
• 1 人β-防御素的結(jié)構(gòu)10-11
• 2 HBD-3的生物學(xué)功能11-14
• 3 HBD-3應(yīng)用14-16
• 第二章：研究內(nèi)容一重組β防御素3載體的構(gòu)建16-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-27
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析27-34
• 4 討論34-36
• 研究內(nèi)容二：重組β防御素3對(duì)白念珠菌及的金黃色葡萄球菌的作用36-47
• 1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-41
• 3 結(jié)果41-45
• 4 討論45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 致謝53-54

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊學(xué)明;何荊洲;張立;黃雄軍;郭亞芬;蔣和生;;革胡子鯰生長激素成熟肽cDNA克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年35期

2 宋玲玲;李欣;王洪梅;高遠(yuǎn)東;王立群;仲躋峰;何洪彬;;具有綠色熒光標(biāo)記的表達(dá)T7 RNA聚合酶穩(wěn)定細(xì)胞系的建立[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年05期

3 Rajaretinam Rajesh Kannan;Appadurai Muthamil Iniyan;Vincent Samuel Gnana Prakashy;;Isolation of a small molecule with anti-MRSA activity from a mangrove symbiont Streptomyces sp.PVRK-1 and its biomedical studies in Zebrafish embryos[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2011年05期

4 宋玲玲;李欣;王洪梅;高運(yùn)東;王立群;仲躋峰;何洪彬;;具有綠色熒光標(biāo)記的表達(dá)T7 RNA聚合酶的穩(wěn)定細(xì)胞系的建立(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2010年Z1期

5 侯國賓;孟慶雄;宋玉竹;;抗菌肽臨床應(yīng)用前景分析[J];生命科學(xué);2012年04期

6 馬君蘭;束長龍;劉東明;張杰;宋福平;黃大f ;;大腸桿菌中利用蘇云金芽胞桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子p1Ac指導(dǎo)Cry1Ac蛋白表達(dá)的特性分析[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年02期

7 鄒輝琴;溫靜;韓雄;陳帆;李鋼;;抗菌肽在產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J];飼料博覽;2013年07期

8 夏麗潔;張富春;;抗菌肽的研究概述及前景展望[J];生物技術(shù);2013年04期

9 虞結(jié)梅;楊兵;謝燦;陸燕燕;何金生;;T7 RNA聚合酶的克隆及其介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄功能的鑒定[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

10 李欣;楊少華;王洪梅;劉曉;武建明;高運(yùn)東;王立群;仲躋峰;何洪彬;;穩(wěn)定表達(dá)T7 RNAP的BHK-21細(xì)胞系的建立[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 鄢然;1b型HCV研究模型的建立及蝎源抗菌肽抑制HCV感染的初步探討[D];武漢大學(xué);2010年

2 肖香;肴肉微生物多樣性與特定腐敗菌控制機(jī)制研究[D];江蘇大學(xué);2013年

3 嚴(yán)秀文;牛虻唾液腺免疫抑制肽Immunoregulin HA及大熊貓抗菌肽PC的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 李，

本文編號(hào)：615072