本文關(guān)鍵詞：氯胺酮相關(guān)性膀胱炎大鼠模型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及候選蛋白Transgelin的表達(dá)驗(yàn)證

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【摘要】：背景和目的 氯胺酮是苯環(huán)己哌啶的衍生物,是一種分離性麻醉藥物。然而,越來越多的年輕人將它當(dāng)作是一種娛樂性藥物而濫用。有不少的臨床病例報(bào)道已經(jīng)指出：長(zhǎng)期濫用氯胺酮會(huì)導(dǎo)致泌尿系病變,引起下尿路癥狀,如尿頻、尿急、恥骨上區(qū)疼痛和血尿。對(duì)濫用氯胺酮的患者進(jìn)行膀胱鏡檢查及膀胱組織活檢,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其病變與間質(zhì)性膀胱炎(Interstitial Cystitis, IC)相類似。病情嚴(yán)重的患者常有膀胱體積減少及不可逆的腎功能損害。有學(xué)者認(rèn)為,氯胺酮及其代謝產(chǎn)物可能對(duì)膀胱粘膜上皮產(chǎn)生直接毒性作用,繼發(fā)引起粘膜下層及膀胱平滑肌的炎癥反應(yīng),從而引起膀胱攣縮及一些與間質(zhì)性膀胱炎類似的病變。但是氯胺酮導(dǎo)致類似間質(zhì)性膀胱炎的病因?qū)W、疾病進(jìn)展、預(yù)后及治療方法仍未明確。 在前期的研究中,我們已經(jīng)初步摸索出建立氯胺酮相關(guān)性膀胱炎的大鼠模型的條件。大鼠在連續(xù)接受腹腔注射氯胺酮16周后,出現(xiàn)了嚴(yán)重的尿頻和肉眼血尿,病理學(xué)檢查結(jié)果顯示膀胱粘膜上皮層增厚伴隨上皮纖維化、炎性細(xì)胞浸潤等炎性病變。在本研究中,我們使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在組織學(xué)水平去研究氯胺酮相關(guān)性膀胱炎疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)蛋白,為闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展,尋找疾病早期診斷和治療的靶標(biāo)提供初步的理論依據(jù)。 方法 1.建立氯胺酮相關(guān)性膀胱炎大鼠模型及膀胱組織病理學(xué)分析 采用2月齡,體重為180±10g的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只,隨機(jī)分為空白對(duì)照control,生理鹽水NS,低劑量組LK (10mg/kg),高劑量組HK(50mg/kg),飼養(yǎng)時(shí)間為16周。每只大鼠分別飼養(yǎng)在單獨(dú)的代謝籠中,每日上午9時(shí)每組分別予腹腔注射500μl生理鹽水,10mg/kg及50mg/kg氯胺酮。大鼠每周測(cè)量一次體重調(diào)整注射劑量。16周后,各組大鼠膀胱組織取材后行HE、Masson染色,觀察膀胱粘膜層、粘膜下層及平滑肌層的組織學(xué)形態(tài)。 2.氯胺酮相關(guān)性膀胱炎大鼠模型膀胱組織的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳 收集NS組及HK組的膀胱標(biāo)本,使用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行了差異表達(dá)雙向凝膠電泳分析。使用凝膠圖像分析軟件并結(jié)合人工比對(duì)從匹配點(diǎn)中篩選出兩組間有顯著性表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)(P0.05),并從中挑選出表達(dá)差異1.5倍以上的蛋白點(diǎn),進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析。 3.雙向凝膠電泳差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定 對(duì)挑選出的差異蛋白斑點(diǎn),通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定分析,對(duì)得到的肽質(zhì)量指紋圖譜及其等電點(diǎn)、分子量、物種來源等參數(shù)在Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。 4.差異蛋白的免疫印跡驗(yàn)證 采用免疫組化及western blot的方法對(duì)篩選鑒定出的差異蛋白進(jìn)行蛋白水平的表達(dá)驗(yàn)證。使用磷酸化蛋白親和色譜分離方法分離各組膀胱組織中的磷酸化及非磷酸化蛋白。使用western blot的方法檢測(cè)各組膀胱組織中磷酸化及非磷酸化的候選差異蛋白的表達(dá)水平。 5.大鼠膀胱組織磷酸化蛋白的差異凝膠雙向電泳及質(zhì)譜鑒定 以NS組及HK組膀胱組織的磷酸化蛋白為研究對(duì)象,使用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行電泳分析,解析前述的雙向電泳、免疫組化及western blot的檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果 1.成功建立了氯胺酮相關(guān)性膀胱炎SD大鼠模型,LK、HK組大鼠均出現(xiàn)尿頻、血尿等下尿路癥狀。HK組膀胱組織HE病理染色顯示膀胱粘膜上皮層增厚,粘膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤；Masson染色結(jié)果顯示,與CON組及NS組相比,長(zhǎng)期應(yīng)用氯胺酮的HK組及LK組黏膜下層和肌層的纖維組織和膠原組織含量增加,染色深染。 2.成功得到氯胺酮相關(guān)性膀胱炎膀胱組織和生理鹽水對(duì)照組膀胱組織的雙向電泳圖譜,共得到1200多個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn),使用凝膠分析軟件分析了差異蛋白斑點(diǎn),篩選出表達(dá)差異1.5倍及以上的蛋白點(diǎn)30個(gè)。 3.MALDI-TOF/MS儀結(jié)合Mascot數(shù)據(jù)庫對(duì)上述30個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定。最后成功鑒定差異表達(dá)蛋白29個(gè),其中14個(gè)蛋白斑點(diǎn)在HK組膀胱組織中表達(dá)上調(diào),它們分別被鑒定為T-激肽原,肌動(dòng)蛋白絲束蛋白,ATP檸檬酸合成酶,線粒體乙醛脫氫酶,肌動(dòng)蛋白,熱休克蛋白β-6,轉(zhuǎn)膠蛋白,蛋白質(zhì)S100-A6及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子5A-1。15個(gè)蛋白斑點(diǎn)在HK組膀胱組織中表達(dá)下調(diào),它們分別被鑒定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素,含PCI區(qū)域蛋白2,血清白蛋白,角蛋白,蛋白質(zhì)二硫腱異構(gòu)酶A3,動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白,磷酸賴氨酸組氨酸焦磷酸鹽磷酸酶,層粘連蛋白-A/C,醛糖還原酶,2-氧化戊二酸脫氫酶-二氫脂賴氨酸基琥珀酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物,1,6果糖雙磷酸酶,磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化蛋白α及轉(zhuǎn)膠蛋白。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)篩選出的蛋白僅有轉(zhuǎn)膠蛋白Transgelin曾在研究報(bào)道過與膀胱損害有相關(guān)性,其表達(dá)可能與間質(zhì)性膀胱炎發(fā)生發(fā)展可能相關(guān),其余蛋白目前暫未見與膀胱炎的相關(guān)報(bào)道。 4.免疫組織化學(xué)及western blot結(jié)果顯示Transgelin蛋白在空白對(duì)照組、NS組、LK組及HK組間的表達(dá)水平無明顯差異(P0.05)。磷酸化形式的Transgelin蛋白在HK組、LK組的表達(dá)水平均高于CON組及NS組(P0.05),而非磷酸化形式的Transgelin蛋白在HK組、LK組的表達(dá)水平均低于CON組及NS組(P0.05)。 5.成功得到HK組和NS組膀胱磷酸化蛋白的雙向電泳圖譜,使用凝膠分析軟件分析了差異蛋白斑點(diǎn),篩選出表達(dá)差異1.5倍及以上的蛋白點(diǎn)11個(gè)。最后成功鑒定差異表達(dá)蛋白8個(gè)斑點(diǎn)在HK組中表達(dá)上調(diào),它們分別被鑒定為：同型原肌球蛋白α-1、真核細(xì)胞翻譯起始因子2-1、轉(zhuǎn)膠蛋白、肌動(dòng)蛋白、蛋白酶β3型、肌球蛋白調(diào)控子輕鏈多肽-9、肌球蛋白調(diào)控子輕鏈RLC-A及My16蛋白。 結(jié)論： 1.成功建立氯胺酮相關(guān)性膀胱炎大鼠模型,膀胱組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示膀胱病變與臨床患者病變相似； 2.采用雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法鑒定了29個(gè)差異表達(dá)蛋白,篩選出氯胺酮相關(guān)性膀胱炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白1個(gè)； 3.轉(zhuǎn)膠蛋白(Transgelin)是本研究篩選獲得的蛋白。Transgelin在膀胱平滑肌組織中的磷酸化形式的表達(dá)量明顯上調(diào),進(jìn)一步行磷酸化蛋白的雙向凝膠蛋白電泳、western blot驗(yàn)證及查閱相關(guān)研究資料后,我們提出以下假說：長(zhǎng)期濫用氯胺酮,可能會(huì)促進(jìn)膀胱平滑肌中的Transgelin的磷酸化修飾,阻礙它與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合,最終破壞平滑肌細(xì)胞的正常調(diào)控及影響膀胱的收縮功能。它可能是一種有應(yīng)用價(jià)值的預(yù)測(cè)氯胺酮相關(guān)性膀胱炎發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：蛋白質(zhì)組 氯胺酮相關(guān)性膀胱炎 雙向凝膠電泳 轉(zhuǎn)膠蛋白 磷酸化蛋白
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R694.3
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-18
• 第一章 建立氯胺酮相關(guān)性膀胱炎大鼠模型18-27
• 1. 研究背景18-19
• 2. 材料與方法19-22
• 3. 結(jié)果22-25
• 4. 討論25-27
• 第二章 氯胺酮相關(guān)性膀胱炎的蛋白質(zhì)組雙向差異電泳分析及質(zhì)譜鑒定27-44
• 1. 研究背景27
• 2. 材料與方法27-35
• 3. 結(jié)果35-41
• 4. 討論41-44
• 第三章 差異候選蛋白的免疫印跡驗(yàn)證和模型動(dòng)物膀胱磷酸化蛋白的雙向凝膠電泳分析及質(zhì)譜鑒定44-61
• 1. 研究背景44
• 2. 材料與方法44-53
• 3. 結(jié)果53-58
• 4. 討論58-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 全文總結(jié)66-68
• 縮寫詞簡(jiǎn)表68-69
• 碩士研究生期間參與發(fā)表論文情況69-70
• 致謝70-71

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 項(xiàng)國聯(lián);裴春明;李天佐;;氯胺酮復(fù)合異丙酚鎮(zhèn)靜用于老年男性膀胱鏡檢查的臨床研究[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;2006年07期

2 孫立國;苑光輝;馬魯飛;;腺性膀胱炎的診斷和治療(附38例報(bào)告)[J];華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年03期

3 劉r，

本文編號(hào)：605951