本文關鍵詞：鰻弧菌減毒活疫苗和載體疫苗候選株的開發(fā)

  更多相關文章： 鰻弧菌 限鐵調控 細菌裂解 減毒活疫苗 Tn7轉座子 載體疫苗

【摘要】：減毒活疫苗具有給藥方便、所需劑量低、可誘發(fā)較強免疫反應等優(yōu)點,成為疫苗中的優(yōu)選類型。目前利用基因工程手段開發(fā)的減毒活疫苗,雖然減毒效果顯著,但其侵染宿主及在宿主內繁殖的能力被減弱,使其免疫效果受到影響。本課題選取鐵調控啟動子Pviua為體內誘導型啟動子,分別控制不同噬菌體裂解基因的表達,包括來源于大腸桿菌噬菌體PhiX174的裂解基因E、來源于λ噬菌體的裂解基因S-R-Rz以及來源于沙門氏菌噬菌體P22的裂解基因13-19-15,從而在鰻弧菌(Vibrio anguillarum)中篩選建立了高效的體內誘導型裂解系統(tǒng)Pviua-13-19-15。含有該系統(tǒng)的重組鰻弧菌在體外富鐵培養(yǎng)基中正常生長,并具有天然的侵染能力。當重組鰻弧菌進入魚體后,響應體內的低鐵信號,開啟噬菌體裂解基因的表達,使鰻弧菌快速裂解死亡。上述策略保證了鰻弧菌在侵入宿主的過程保持了天然毒株的侵染能力,進入魚體后通過細菌裂解達到減毒的目的。將該系統(tǒng)導入鰻弧菌MVM425,得到候選疫苗株425/pUTP22。將該候選疫苗株在斑馬魚中進行了毒力和免疫效力評價,結果表明：該疫苗株與野生株相比,減毒效果明顯,且注射和浸泡免疫的相對免疫保護率均超過80%,具有較好的應用價值。 細菌載體疫苗通常是指在減毒活菌中進行異源抗原的表達,從而實現(xiàn)一苗多價的目的。細菌載體疫苗因不需佐劑、強免疫原性、可攜帶不同抗原及類似病原菌的侵染力等特性,廣泛應用于疫苗的開發(fā)。載體疫苗通常采用以質粒為載體的抗原表達模式,此模式存在質粒遺傳不穩(wěn)定、殘留抗性標記、抗原過度表達導致細菌代謝負擔等問題。為了解決上述問題,我們在鰻弧菌、大腸桿菌(Escherichia coli)和遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)中建立了無抗生素標記的Tn7轉座系統(tǒng),并利用Tn7轉座子系統(tǒng)將來源于嗜水氣單胞菌抗原基因gapA的表達結構整合到了鰻弧菌減毒活疫苗MVAV6203株的染色體上,實現(xiàn)了異源抗原在減毒鰻弧菌中的穩(wěn)定表達。同時將已構建的體內裂解系統(tǒng)Rviua-13-19-15導入減毒鰻弧菌中,以實現(xiàn)減毒菌株的體內裂解,有利于增強鰻弧菌載體疫苗的安全性和抗原釋放效果。
【關鍵詞】：鰻弧菌 限鐵調控 細菌裂解 減毒活疫苗 Tn7轉座子 載體疫苗
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 綜述與導言11-23
• 1.1 海水魚類養(yǎng)殖11-13
• 1.1.1 鰻弧菌11-12
• 1.1.2 水產養(yǎng)殖中的疾病控制12-13
• 1.2 減毒活疫苗和載體疫苗13-15
• 1.2.1 減毒活疫苗13-14
• 1.2.2 載體疫苗14-15
• 1.3 Tn7轉座子15-19
• 1.3.1 Tn7轉座子15-16
• 1.3.2 Tn7轉座子所需要的元件16
• 1.3.3 Tn7轉座子所需要的酶16-17
• 1.3.4 Tn7轉座所需要的工具17
• 1.3.5 Tn7轉座子的應用17-19
• 1.4 位點特異性重組系統(tǒng)19-20
• 1.5 裂解基因20-22
• 1.6 本論文的主要內容和意義22-23
• 第2章 不同噬菌體的裂解基因的篩選23-40
• 2.1 引言23
• 2.2 實驗用的材料23-26
• 2.2.1 菌株和質粒23
• 2.2.2 藥品、試劑和儀器23-24
• 2.2.3 PCR引物24
• 2.2.4 培養(yǎng)基和試劑24-26
• 2.3 實驗方法26-31
• 2.3.1 細菌培養(yǎng)及菌種保藏26
• 2.3.2 細菌質粒的提取26
• 2.3.3 DNA的酶切26-27
• 2.3.4 DNA的連接27
• 2.3.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳27
• 2.3.6 DNA的回收27
• 2.3.7 PCR實驗27-28
• 2.3.8 大腸桿菌鈣轉感受態(tài)的制備(鈣轉法)28-29
• 2.3.9 大腸桿菌鈣轉化法29
• 2.3.10 鰻弧菌電擊轉化感受態(tài)的制備29-30
• 2.3.11 鰻弧菌的電擊轉化30
• 2.3.12 掃描電子顯微鏡(SEM)樣品的制備30-31
• 2.4 結果與討論31-39
• 2.4.1 不同裂解基因的克隆及裂解質粒的構建31-34
• 2.4.2 帶不同裂解質粒大腸桿菌的裂解效果的測定34-36
• 2.4.3 檢測不同裂解質粒在鰻弧菌中的裂解效果36-38
• 2.4.4 鰻弧菌裂解效果的掃描電鏡觀察38-39
• 2.5 本章小結39-40
• 第3章 基于限鐵裂解系統(tǒng)的鰻弧菌減毒活疫苗開發(fā)40-45
• 3.1 引言40
• 3.2 實驗用的材料40
• 3.2.1 菌株和質粒40
• 3.2.2 藥品和試劑40
• 3.2.3 PCR引物40
• 3.2.4 試劑40
• 3.2.5 實驗動物40
• 3.3 實驗方法40-42
• 3.3.1 疫苗株的毒性評價41
• 3.3.2 疫苗株的免疫保護力評價41-42
• 3.4 結果與討論42-44
• 3.4.1 鰻弧菌減毒活疫苗的構建及限鐵誘導裂解的測定42-43
• 3.4.2 425/pUTP22的減毒效果43-44
• 3.5 本章小結44-45
• 第4章 Tn7轉座子的開發(fā)應用45-56
• 4.1 引言45
• 4.2 實驗用的材料45-46
• 4.2.1 菌株和質粒45-46
• 4.2.2 藥品和試劑46
• 4.2.3 PCR引物46
• 4.2.4 試劑46
• 4.3 實驗方法46-49
• 4.3.1 細菌培養(yǎng)及菌種保藏47
• 4.3.2 平末端連接實驗47-48
• 4.3.3 鰻弧菌的四親本接合48
• 4.3.4 遲鈍愛德華氏菌的四親本接合48-49
• 4.3.5 大腸桿菌的雙質粒共轉化49
• 4.3.6 抗性消除實驗49
• 4.4 結果與討論49-55
• 4.4.0 分析鰻弧菌、遲鈍愛德華氏菌和大腸桿菌中的attTn7位點49-50
• 4.4.1 Tn7轉座子傳遞質粒的構建50-51
• 4.4.2 Tn7轉座子在鰻弧菌中的應用51-52
• 4.4.3 Tn7轉座子在遲鈍愛德華氏菌中的應用52-53
• 4.4.4 Tn7轉座子在大腸桿菌中的應用53-54
• 4.4.5 Tn7插入鰻弧菌后的抗性基因消除54-55
• 4.5 本章小結55-56
• 第5章 鰻弧菌載體疫苗的開發(fā)56-62
• 5.1 引言56
• 5.2 實驗用的材料56-57
• 5.2.1 菌株和質粒56
• 5.2.2 藥品和試劑56
• 5.2.3 PCR引物56-57
• 5.2.4 試劑57
• 5.3 實驗方法57-58
• 5.4 結果與討論58-61
• 5.4.1 雙質粒系統(tǒng)58
• 5.4.2 單質粒系統(tǒng)58-59
• 5.4.3 抗原的染色體整合59-61
• 5.5 本章小結61-62
• 第6章 總結與展望62-64
• 6.1 全文總結62-63
• 6.2 展望63-64
• 參考文獻64-71
• 致謝71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 智海東;王云峰;陳洪巖;;我國獸用基因工程疫苗研發(fā)現(xiàn)狀與策略[J];動物醫(yī)學進展;2011年06期

2 楊宇峰;王慶;聶湘平;王朝暉;;海水養(yǎng)殖發(fā)展與漁業(yè)環(huán)境管理研究進展[J];暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版);2012年05期

3 孫娟;楊德利;;我國海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展研究[J];山西農業(yè)科學;2011年07期

4 雷霽霖;;中國海水養(yǎng)殖大產業(yè)架構的戰(zhàn)略思考[J];中國水產科學;2010年03期

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本文編號：604123