發(fā)布時間：2017-08-01 12:04

  本文關(guān)鍵詞：鰻弧菌減毒活疫苗和載體疫苗候選株的開發(fā)

  更多相關(guān)文章： 鰻弧菌 限鐵調(diào)控 細(xì)菌裂解 減毒活疫苗 Tn7轉(zhuǎn)座子 載體疫苗

【摘要】：減毒活疫苗具有給藥方便、所需劑量低、可誘發(fā)較強(qiáng)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),成為疫苗中的優(yōu)選類型。目前利用基因工程手段開發(fā)的減毒活疫苗,雖然減毒效果顯著,但其侵染宿主及在宿主內(nèi)繁殖的能力被減弱,使其免疫效果受到影響。本課題選取鐵調(diào)控啟動子Pviua為體內(nèi)誘導(dǎo)型啟動子,分別控制不同噬菌體裂解基因的表達(dá),包括來源于大腸桿菌噬菌體PhiX174的裂解基因E、來源于λ噬菌體的裂解基因S-R-Rz以及來源于沙門氏菌噬菌體P22的裂解基因13-19-15,從而在鰻弧菌(Vibrio anguillarum)中篩選建立了高效的體內(nèi)誘導(dǎo)型裂解系統(tǒng)Pviua-13-19-15。含有該系統(tǒng)的重組鰻弧菌在體外富鐵培養(yǎng)基中正常生長,并具有天然的侵染能力。當(dāng)重組鰻弧菌進(jìn)入魚體后,響應(yīng)體內(nèi)的低鐵信號,開啟噬菌體裂解基因的表達(dá),使鰻弧菌快速裂解死亡。上述策略保證了鰻弧菌在侵入宿主的過程保持了天然毒株的侵染能力,進(jìn)入魚體后通過細(xì)菌裂解達(dá)到減毒的目的。將該系統(tǒng)導(dǎo)入鰻弧菌MVM425,得到候選疫苗株425/pUTP22。將該候選疫苗株在斑馬魚中進(jìn)行了毒力和免疫效力評價(jià),結(jié)果表明：該疫苗株與野生株相比,減毒效果明顯,且注射和浸泡免疫的相對免疫保護(hù)率均超過80%,具有較好的應(yīng)用價(jià)值。 細(xì)菌載體疫苗通常是指在減毒活菌中進(jìn)行異源抗原的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)一苗多價(jià)的目的。細(xì)菌載體疫苗因不需佐劑、強(qiáng)免疫原性、可攜帶不同抗原及類似病原菌的侵染力等特性,廣泛應(yīng)用于疫苗的開發(fā)。載體疫苗通常采用以質(zhì)粒為載體的抗原表達(dá)模式,此模式存在質(zhì)粒遺傳不穩(wěn)定、殘留抗性標(biāo)記、抗原過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)菌代謝負(fù)擔(dān)等問題。為了解決上述問題,我們在鰻弧菌、大腸桿菌(Escherichia coli)和遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)中建立了無抗生素標(biāo)記的Tn7轉(zhuǎn)座系統(tǒng),并利用Tn7轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將來源于嗜水氣單胞菌抗原基因gapA的表達(dá)結(jié)構(gòu)整合到了鰻弧菌減毒活疫苗MVAV6203株的染色體上,實(shí)現(xiàn)了異源抗原在減毒鰻弧菌中的穩(wěn)定表達(dá)。同時將已構(gòu)建的體內(nèi)裂解系統(tǒng)Rviua-13-19-15導(dǎo)入減毒鰻弧菌中,以實(shí)現(xiàn)減毒菌株的體內(nèi)裂解,有利于增強(qiáng)鰻弧菌載體疫苗的安全性和抗原釋放效果。
【關(guān)鍵詞】：鰻弧菌 限鐵調(diào)控 細(xì)菌裂解 減毒活疫苗 Tn7轉(zhuǎn)座子 載體疫苗
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 綜述與導(dǎo)言11-23
• 1.1 海水魚類養(yǎng)殖11-13
• 1.1.1 鰻弧菌11-12
• 1.1.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疾病控制12-13
• 1.2 減毒活疫苗和載體疫苗13-15
• 1.2.1 減毒活疫苗13-14
• 1.2.2 載體疫苗14-15
• 1.3 Tn7轉(zhuǎn)座子15-19
• 1.3.1 Tn7轉(zhuǎn)座子15-16
• 1.3.2 Tn7轉(zhuǎn)座子所需要的元件16
• 1.3.3 Tn7轉(zhuǎn)座子所需要的酶16-17
• 1.3.4 Tn7轉(zhuǎn)座所需要的工具17
• 1.3.5 Tn7轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用17-19
• 1.4 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)19-20
• 1.5 裂解基因20-22
• 1.6 本論文的主要內(nèi)容和意義22-23
• 第2章 不同噬菌體的裂解基因的篩選23-40
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)用的材料23-26
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.2.2 藥品、試劑和儀器23-24
• 2.2.3 PCR引物24
• 2.2.4 培養(yǎng)基和試劑24-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 2.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及菌種保藏26
• 2.3.2 細(xì)菌質(zhì)粒的提取26
• 2.3.3 DNA的酶切26-27
• 2.3.4 DNA的連接27
• 2.3.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳27
• 2.3.6 DNA的回收27
• 2.3.7 PCR實(shí)驗(yàn)27-28
• 2.3.8 大腸桿菌鈣轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備(鈣轉(zhuǎn)法)28-29
• 2.3.9 大腸桿菌鈣轉(zhuǎn)化法29
• 2.3.10 鰻弧菌電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備29-30
• 2.3.11 鰻弧菌的電擊轉(zhuǎn)化30
• 2.3.12 掃描電子顯微鏡(SEM)樣品的制備30-31
• 2.4 結(jié)果與討論31-39
• 2.4.1 不同裂解基因的克隆及裂解質(zhì)粒的構(gòu)建31-34
• 2.4.2 帶不同裂解質(zhì)粒大腸桿菌的裂解效果的測定34-36
• 2.4.3 檢測不同裂解質(zhì)粒在鰻弧菌中的裂解效果36-38
• 2.4.4 鰻弧菌裂解效果的掃描電鏡觀察38-39
• 2.5 本章小結(jié)39-40
• 第3章 基于限鐵裂解系統(tǒng)的鰻弧菌減毒活疫苗開發(fā)40-45
• 3.1 引言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)用的材料40
• 3.2.1 菌株和質(zhì)粒40
• 3.2.2 藥品和試劑40
• 3.2.3 PCR引物40
• 3.2.4 試劑40
• 3.2.5 實(shí)驗(yàn)動物40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法40-42
• 3.3.1 疫苗株的毒性評價(jià)41
• 3.3.2 疫苗株的免疫保護(hù)力評價(jià)41-42
• 3.4 結(jié)果與討論42-44
• 3.4.1 鰻弧菌減毒活疫苗的構(gòu)建及限鐵誘導(dǎo)裂解的測定42-43
• 3.4.2 425/pUTP22的減毒效果43-44
• 3.5 本章小結(jié)44-45
• 第4章 Tn7轉(zhuǎn)座子的開發(fā)應(yīng)用45-56
• 4.1 引言45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)用的材料45-46
• 4.2.1 菌株和質(zhì)粒45-46
• 4.2.2 藥品和試劑46
• 4.2.3 PCR引物46
• 4.2.4 試劑46
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法46-49
• 4.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及菌種保藏47
• 4.3.2 平末端連接實(shí)驗(yàn)47-48
• 4.3.3 鰻弧菌的四親本接合48
• 4.3.4 遲鈍愛德華氏菌的四親本接合48-49
• 4.3.5 大腸桿菌的雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化49
• 4.3.6 抗性消除實(shí)驗(yàn)49
• 4.4 結(jié)果與討論49-55
• 4.4.0 分析鰻弧菌、遲鈍愛德華氏菌和大腸桿菌中的attTn7位點(diǎn)49-50
• 4.4.1 Tn7轉(zhuǎn)座子傳遞質(zhì)粒的構(gòu)建50-51
• 4.4.2 Tn7轉(zhuǎn)座子在鰻弧菌中的應(yīng)用51-52
• 4.4.3 Tn7轉(zhuǎn)座子在遲鈍愛德華氏菌中的應(yīng)用52-53
• 4.4.4 Tn7轉(zhuǎn)座子在大腸桿菌中的應(yīng)用53-54
• 4.4.5 Tn7插入鰻弧菌后的抗性基因消除54-55
• 4.5 本章小結(jié)55-56
• 第5章 鰻弧菌載體疫苗的開發(fā)56-62
• 5.1 引言56
• 5.2 實(shí)驗(yàn)用的材料56-57
• 5.2.1 菌株和質(zhì)粒56
• 5.2.2 藥品和試劑56
• 5.2.3 PCR引物56-57
• 5.2.4 試劑57
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法57-58
• 5.4 結(jié)果與討論58-61
• 5.4.1 雙質(zhì)粒系統(tǒng)58
• 5.4.2 單質(zhì)粒系統(tǒng)58-59
• 5.4.3 抗原的染色體整合59-61
• 5.5 本章小結(jié)61-62
• 第6章 總結(jié)與展望62-64
• 6.1 全文總結(jié)62-63
• 6.2 展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：604123