本文關(guān)鍵詞：蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究

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【摘要】：目的構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala),轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115。篩選多拷貝陽性菌株,甲醇誘導(dǎo)多拷貝陽性菌株表達(dá)融合蛋白,分離純化該融合蛋白,并進(jìn)行抗菌及抗腫瘤生物學(xué)活性研究。 方法以質(zhì)粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板,PCR獲得目的基因,構(gòu)建重組載體pPICZa A/M-IL-2(88Arg,125Ala);通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115; MMH,MDH篩選Mut+表型陽性菌株GS115; ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法篩選多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá),提取上清,SDS-PAGE及BCA法檢測(cè)最佳誘導(dǎo)時(shí)間,Western blot鑒定抗原性及特異性。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀法、透析法、鎳離子親和層析純化融合蛋白；液相測(cè)定法研究融合蛋白抑菌活性,CCK-8法檢測(cè)該融合蛋白抗腫瘤活性。 結(jié)果成功構(gòu)建畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化菌株GS115/M-IL-2(88Arg,'25Ala).經(jīng)MDH及MMH篩選出Mut+型重組菌株GS115/M-IL-2(88Arg,125Ala)。ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法成功篩選出兩株多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。SDS-PAGE檢測(cè)在26kDa左右有明顯目的條帶,與理論值相符。BCA法測(cè)定甲醇誘導(dǎo)120h融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最高濃度814.5mg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該融合蛋白在原核系統(tǒng)中產(chǎn)量。Western blot鑒定該融合蛋白具有抗原特異性。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀法、透析法、鎳離子親和層析法獲得純度為99%的目的蛋白,經(jīng)濃縮管濃縮獲得濃度為432.5mg/L的目的蛋白5mL。經(jīng)檢測(cè)純化的融合蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長活性,具有較強(qiáng)抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞及Hela的生長增殖的生物活性。 結(jié)論成功構(gòu)建畢赤酵母分泌表達(dá)重組載體pPICZa A/M-IL-2(88Arg,125Ala),篩選出可以穩(wěn)定高表達(dá)的多拷貝重組菌株,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化,獲得具有抑菌活性,抗腫瘤活性的高純度融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)。為進(jìn)一步研究制備低毒、高效的新型抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：M-IL-2(~(88)Arg ~(125)Ala) 畢赤酵母 表達(dá) 純化 生物活性
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-10
• 第一章 材料與儀器10-17
• 1.1 細(xì)胞10
• 1.2 質(zhì)粒和菌株10
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法10-15
• 1.3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑10-11
• 1.3.2 主要試劑配制方法11-15
• 1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備15-17
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方法17-30
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建17-18
• 2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成17
• 2.1.2 目的基因擴(kuò)增及載體構(gòu)建17-18
• 2.2 重組質(zhì)粒擴(kuò)增18-19
• 2.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α18-19
• 2.3 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115及陽性菌株篩選19-20
• 2.4 畢赤酵母GS115重組子鑒定20-21
• 2.4.1 畢赤酵母全基因的提取20-21
• 2.4.2 PCR鑒定重組子21
• 2.5 陽性菌株Mut表型鑒定21
• 2.6 多拷貝陽性菌株的篩選與鑒定21-22
• 2.7 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白22
• 2.8 TCA沉淀、SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物22-24
• 2.8.1 TCA法沉淀蛋白22-23
• 2.8.2 SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物23-24
• 2.9 Western blot鑒定目的蛋白24-25
• 2.10 目的蛋白的純化25-27
• 2.11 融合蛋白的生物活性檢測(cè)27-30
• 2.11.1 融合蛋白的抑菌活性檢測(cè)27-28
• 2.11.2 融合蛋白對(duì)人卵巢癌細(xì)胞生長增殖作用28-29
• 2.11.3 融合蛋白對(duì)Hela細(xì)胞生長增殖的作用29-30
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-41
• 3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定30-33
• 3.1.1 目的基因獲取30-32
• 3.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定32-33
• 3.2 重組酵母菌株的篩選及鑒定33-34
• 3.3 重組酵母菌株mut表型鑒定34-35
• 3.4 多拷貝菌株篩選及鑒定35-36
• 3.5 陽性菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定36-37
• 3.6 融合蛋白純化結(jié)果37-38
• 3.7 融合蛋白生物活性檢測(cè)38-41
• 3.7.1 融合蛋白抑菌活性檢測(cè)38-39
• 3.7.2 融合蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長增殖作用檢測(cè)39-40
• 3.7.3 融合蛋白對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞生長增殖作用檢測(cè)40-41
• 第四章 討論41-44
• 4.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的探討41
• 4.2 融合蛋M-IL-2(88Arg,125Ala)在畢赤酵母中表達(dá)效果探討41-42
• 4.3 融合蛋白質(zhì)純化方法的探討42-43
• 4.4 融合蛋白的生物活性探討43-44
• 第五章 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 攻讀學(xué)位期間研究成果61-62
• 致謝62-63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孟林;劉明軍;王斌;錢冬萌;;~(88)Arg IL-2的克隆構(gòu)建及原核表達(dá)[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年04期

2 陳Z，

本文編號(hào)：590474