本文關(guān)鍵詞：蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在畢赤酵母中的表達、純化及生物學活性研究

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【摘要】：目的構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala),轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115。篩選多拷貝陽性菌株,甲醇誘導多拷貝陽性菌株表達融合蛋白,分離純化該融合蛋白,并進行抗菌及抗腫瘤生物學活性研究。 方法以質(zhì)粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板,PCR獲得目的基因,構(gòu)建重組載體pPICZa A/M-IL-2(88Arg,125Ala);通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115; MMH,MDH篩選Mut+表型陽性菌株GS115; ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法篩選多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇持續(xù)誘導表達,提取上清,SDS-PAGE及BCA法檢測最佳誘導時間,Western blot鑒定抗原性及特異性。經(jīng)硫酸銨分級沉淀法、透析法、鎳離子親和層析純化融合蛋白；液相測定法研究融合蛋白抑菌活性,CCK-8法檢測該融合蛋白抗腫瘤活性。 結(jié)果成功構(gòu)建畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化菌株GS115/M-IL-2(88Arg,'25Ala).經(jīng)MDH及MMH篩選出Mut+型重組菌株GS115/M-IL-2(88Arg,125Ala)。ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法成功篩選出兩株多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。SDS-PAGE檢測在26kDa左右有明顯目的條帶,與理論值相符。BCA法測定甲醇誘導120h融合蛋白表達量達到最高濃度814.5mg/L,遠遠高于該融合蛋白在原核系統(tǒng)中產(chǎn)量。Western blot鑒定該融合蛋白具有抗原特異性。經(jīng)硫酸銨分級沉淀法、透析法、鎳離子親和層析法獲得純度為99%的目的蛋白,經(jīng)濃縮管濃縮獲得濃度為432.5mg/L的目的蛋白5mL。經(jīng)檢測純化的融合蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長活性,具有較強抑制人卵巢癌細胞SKOV3細胞及Hela的生長增殖的生物活性。 結(jié)論成功構(gòu)建畢赤酵母分泌表達重組載體pPICZa A/M-IL-2(88Arg,125Ala),篩選出可以穩(wěn)定高表達的多拷貝重組菌株,表達產(chǎn)物經(jīng)純化,獲得具有抑菌活性,抗腫瘤活性的高純度融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)。為進一步研究制備低毒、高效的新型抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：M-IL-2(~(88)Arg ~(125)Ala) 畢赤酵母 表達 純化 生物活性
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-10
• 第一章 材料與儀器10-17
• 1.1 細胞10
• 1.2 質(zhì)粒和菌株10
• 1.3 主要實驗試劑及配制方法10-15
• 1.3.1 主要實驗試劑10-11
• 1.3.2 主要試劑配制方法11-15
• 1.4 實驗儀器和設(shè)備15-17
• 第二章 實驗方法17-30
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建17-18
• 2.1.1 引物設(shè)計與合成17
• 2.1.2 目的基因擴增及載體構(gòu)建17-18
• 2.2 重組質(zhì)粒擴增18-19
• 2.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α18-19
• 2.3 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115及陽性菌株篩選19-20
• 2.4 畢赤酵母GS115重組子鑒定20-21
• 2.4.1 畢赤酵母全基因的提取20-21
• 2.4.2 PCR鑒定重組子21
• 2.5 陽性菌株Mut表型鑒定21
• 2.6 多拷貝陽性菌株的篩選與鑒定21-22
• 2.7 誘導表達目的蛋白22
• 2.8 TCA沉淀、SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物22-24
• 2.8.1 TCA法沉淀蛋白22-23
• 2.8.2 SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物23-24
• 2.9 Western blot鑒定目的蛋白24-25
• 2.10 目的蛋白的純化25-27
• 2.11 融合蛋白的生物活性檢測27-30
• 2.11.1 融合蛋白的抑菌活性檢測27-28
• 2.11.2 融合蛋白對人卵巢癌細胞生長增殖作用28-29
• 2.11.3 融合蛋白對Hela細胞生長增殖的作用29-30
• 第三章 實驗結(jié)果30-41
• 3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定30-33
• 3.1.1 目的基因獲取30-32
• 3.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定32-33
• 3.2 重組酵母菌株的篩選及鑒定33-34
• 3.3 重組酵母菌株mut表型鑒定34-35
• 3.4 多拷貝菌株篩選及鑒定35-36
• 3.5 陽性菌株誘導表達產(chǎn)物的檢測及鑒定36-37
• 3.6 融合蛋白純化結(jié)果37-38
• 3.7 融合蛋白生物活性檢測38-41
• 3.7.1 融合蛋白抑菌活性檢測38-39
• 3.7.2 融合蛋白對卵巢癌細胞SKOV3生長增殖作用檢測39-40
• 3.7.3 融合蛋白對人宮頸癌Hela細胞生長增殖作用檢測40-41
• 第四章 討論41-44
• 4.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)的探討41
• 4.2 融合蛋M-IL-2(88Arg,125Ala)在畢赤酵母中表達效果探討41-42
• 4.3 融合蛋白質(zhì)純化方法的探討42-43
• 4.4 融合蛋白的生物活性探討43-44
• 第五章 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-49
• 文獻綜述49-61
• 參考文獻58-61
• 攻讀學位期間研究成果61-62
• 致謝62-63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孟林;劉明軍;王斌;錢冬萌;;~(88)Arg IL-2的克隆構(gòu)建及原核表達[J];青島大學醫(yī)學院學報;2006年04期

2 陳Z，

本文編號：590474