本文關鍵詞：UL27、UL54基因shRNA聯(lián)合干擾HSV-2復制研究

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【摘要】：目的：研究Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type2, HSV-2) UL27、 UL54基因的重組表達載體shRNA (small hairpin RNA, shRNA)的干擾作用,并探討二者聯(lián)合干擾對HSV-2復制的影響。 方法：構建的UL54、 UL27基因的shRNA表達載體,通過脂質體介導重組表達載體轉染HEK293細胞,采用熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀檢測轉染效率,用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測細胞存活率,通過shRNA重組表達載體和轉染試劑lipofectamine2000不同劑量比例對轉染效率的優(yōu)化,找出轉染效率較高且細胞毒性較低的shRNA重組表達載體與lipofectamine2000的最佳配比。shRNA重組表達載體轉染HEK293細胞后接種HSV-2。采用實時熒光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR)檢測HSV-2UL27、UL54mRNA的表達水平,終點滴定法檢測細胞上清液中的病毒滴度,MTT比色法檢測細胞存活率,蛋白印跡法(Western blot)檢測相應功能蛋白的表達情況,確定UL27、UL54不同靶基因的干擾效率,篩選出UL27、UL54單干擾效率較高的shRNA重組表達載體,并進行聯(lián)合干擾實驗,觀察聯(lián)合干擾對HSV-2復制的影響。 結果：(1)根據(jù)轉染效率以及細胞存活率測定結果,篩選出質粒與轉染試劑復合物的最佳配比為0.8μg:2μl。(2)實時熒光定量PCR結果顯示,UL27、UL54各單干擾組均能不同程度的抑制目的基因mRNA的表達,其中UL27shRNA75組和UL27shRNA2265組對UL27mRNA表達抑制率分別為75.17%、60.22%, UL54shRNA1081組、UL54shRNA1407組對UL54mRNA表達抑制率分別為69.61%、51.46%,與空白對照組相比均具有顯著性差異(P0.05)；聯(lián)合干擾UL27shRNA75+UL54shRNA1081組對目的基因mRNA表達有明顯的降低,抑制效果最佳,對UL27基因mRNA表達抑制率約為88.10%,對UL54基因mRNA表達降低,抑制率約為85.53%,與對照組和單干擾組比較都具有顯著性差異(P0.05)。(3)終點滴定法結果顯示：各干擾組可不同程度降低上清液中的子代病毒感染滴度,其中聯(lián)合干擾UL27shRNA75+UL54shRNA1081組降低病毒滴度最明顯,與空白組比較差異性顯著(P0.01)。(4) MTT法檢測結果顯示,與陰性對照組相比,單干擾組和聯(lián)合干擾組可不同程度提高細胞存活率,其中UL27shRNA75+UL54shRNA1081、UL27shRNA75+UL54shRNA1407組細胞存活率明顯提高,分別為97.3+0.91%、95.7+1.14%,差異有顯著意義(P0.05)。(5) Western blot檢測目的基因蛋白,單干擾組與聯(lián)合干擾組可不同程度降低靶基因蛋白的表達,其中UL27shRNA75+UL54shRNA1081聯(lián)合干擾組能顯著抑制相應的蛋白表達水平,蛋白表達量明顯減少,與單干擾組相比具有顯著差異(P0.05)。 結論：構建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL54重組表達載體,均能在細胞水平上不同程度的干擾HSV-2UL27. UL54基因mRNA的表達,采用UL27、UL54基因聯(lián)合具有更高的干擾效率,能更好的抑制HSV-2在HEK293細胞中復制。
【關鍵詞】：RNA干擾 短發(fā)夾RNA Ⅱ型單純皰疹病毒 UL27基因 UL54基因
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.11
【目錄】：

• 英文縮略詞表3-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 1 材料與方法13-16
• 2 實歐方法16-27
• 3 結果27-39
• 4 討論39-44
• 5 展望44-45
• 6 結論45-46
• 參考文獻46-49
• 綜述：RNAi對HSV-2治療的進展及影響49-59
• 參考文獻56-59
• 致謝59-60
• 作者簡歷60

【參考文獻】

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本文編號：589115