發(fā)布時間：2017-07-27 16:10

  本文關(guān)鍵詞：小分子抑制劑與Mcl-1蛋白作用模式及分子優(yōu)化的研究

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【摘要】：Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,二者通過BH3溝槽發(fā)生的相互作用來決定細(xì)胞是否凋亡。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞的抗凋亡蛋白例如Mcl-1與Bcl-2蛋白的過量表達(dá),使細(xì)胞逃避凋亡,獲得永生。因此抗凋亡蛋白是抗癌藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。靶向Bcl-2抗凋亡蛋白的小分子抑制劑可以通過與抗凋亡蛋白的BH3溝槽結(jié)合,釋放出促凋亡蛋白,導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。Mcl-1和Bcl-2是抗凋亡蛋白的兩個典型代表,同時結(jié)合Bc1-2與Mcl-1蛋白,并拮抗兩個蛋白的功能,是靶向Bcl-2家族小分子抑制劑的發(fā)展方向。由于Mcl-1的BH3溝槽與Bcl-2蛋白有一些差異,因此現(xiàn)有的Bcl-2小分子抑制劑多數(shù)不能同時與Mcl-1蛋白結(jié)合,通過研究小分子抑制劑與Mcl-1蛋白的結(jié)合模式,可以獲得Mcl-1蛋白BH3溝槽的特征性結(jié)構(gòu)信息,指導(dǎo)Mcl-1抑制劑或者M(jìn)cl-1/Bcl-2雙抑制劑的分子設(shè)計(jì),獲得親和力更好的抗癌先導(dǎo)分子。 首先我們構(gòu)建了Mcl-1蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。通過優(yōu)化蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)條件,15N標(biāo)記的Mcl-1蛋白的表達(dá)量達(dá)到7.9mg/L,與未標(biāo)記Mcl-1蛋白的表達(dá)量(8.3mg/L)相仿。通過鎳柱親和層析洗脫條件的優(yōu)化與分子篩層析,將蛋白的純度提高到了95%以上。圓二色譜結(jié)果顯示純化所得Mcl-1蛋白具有正確折疊的二級結(jié)構(gòu)。同時蛋白NMR一維圖譜和二維圖譜結(jié)果顯示,15N標(biāo)記的Mcl-1蛋白的譜峰分散良好,表明其高級結(jié)構(gòu)正確,純化后的蛋白活性良好,滿足后續(xù)的二維核磁實(shí)驗(yàn)的要求。 接著對本課題組設(shè)計(jì)合成的小分子C1(2,3-dihydroxyanthracene-9,10-dione)進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn),獲得了Mcl-1蛋白中與C1的結(jié)合模式,發(fā)現(xiàn)C1與R263形成了氫鍵,C1的蒽醌骨架橫跨R263到p3口袋。然而,骨架末端的苯環(huán)指向Mcl-1蛋白的p3口袋但并未占據(jù)p3口袋。繼續(xù)設(shè)計(jì)了小分子C2(6-bromo-2,3-dihydroxyanthracene-9,10-dione),以占據(jù)Mcl-1蛋白的p3口袋。熒光偏振實(shí)驗(yàn)測得C2對Bcl-2以及Mcl-1蛋白Ki值分別為132nM和107nM,和C1親和力相比分別提高了三倍和四倍。1H-15N HSQC二維核磁結(jié)果表明C2結(jié)合于Mcl-1蛋白表面的BH3結(jié)合溝槽從,其中R263殘基的化學(xué)位移最大。C2的溴原子與Mcl-1蛋白p3口袋的F228殘基相互作用,分子對接實(shí)驗(yàn)也直觀的證明了C2的溴原子占據(jù)了Mcl-1的p3口袋。隨后,在C2的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了C3、C4、C5、C6,用硫原子替換溴原子,并在硫原子上接上較長的取代基,以占據(jù)Mcl-1蛋白的p2口袋。熒光偏振實(shí)驗(yàn)表明這四個小分子對Mcl-1蛋白和Bcl-2蛋白的親和力比C2均有明顯提升,特別是C6小分子(dihydroxy-6-((4-isopropylphenyl)thio)anthracene-9,10-dione),其對Bcl-2和Mcl-1的Ki值分別是24nM和13nM。與C1相比,分別提高了約13倍和38倍。HSQC實(shí)驗(yàn)表明,除了在C2中發(fā)生化學(xué)位移的氨基酸,C6滴定Mcl-1蛋白新增的化學(xué)位移氨基酸殘基包括Mcl-1蛋白p2口袋的M250和F270,證明了C6達(dá)到了與Mcl-1蛋白的p2口袋相互作用的目的。HSQC輔助分子對接的方法指導(dǎo)設(shè)計(jì)了高親和力的Bcl-2/Mcl-1雙抑制劑C6。
【關(guān)鍵詞】：~1H-~(15)N HSQC二維核磁 小分子抑制劑 Mcl-1 結(jié)合模式 分子對接
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1.1 引言10
• 1.2 細(xì)胞凋亡與Bcl-2家族10-15
• 1.2.1 細(xì)胞凋亡10-12
• 1.2.2 Bcl-2家族12-15
• 1.3 Bcl-2家族的重要成員——Mcl-1蛋白15-17
• 1.3.1 Mcl-1蛋白的發(fā)現(xiàn)和特征15-16
• 1.3.2 Mcl-1蛋白的生理學(xué)功能16-17
• 1.4 靶向Bcl-2家族蛋白的抑制劑的研究進(jìn)展17-20
• 1.4.1 ABT-73717-18
• 1.4.2 ABT-26318
• 1.4.3 Obatoclax18
• 1.4.4 TW-3718-19
• 1.4.5 HA 14-119
• 1.4.6 Apogossypolone(ApoG2)19
• 1.4.7 Gossypol19-20
• 1.4.8 白屈菜赤堿20
• 1.5 選題指導(dǎo)思想與研究目的20-21
• 2 Mcl-1蛋白表達(dá)的優(yōu)化21-47
• 2.1 引言21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑21-25
• 2.2.1 菌株與載體21-22
• 2.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)基22-23
• 2.2.3 其它常用試劑配方23-24
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-34
• 2.3.1 重組Mcl-1蛋白的基因克隆25-27
• 2.3.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化27-28
• 2.3.3 未標(biāo)記Mcl-1蛋白的表達(dá)與純化28-29
• 2.3.4 ~(15)N標(biāo)記的Mcl-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)29
• 2.3.5 Mcl-1蛋白的純化29-30
• 2.3.6 目的蛋白的分子篩層析30
• 2.3.7 蛋白定量(考馬斯亮藍(lán)法)30-31
• 2.3.8 Western Blot31-32
• 2.3.9 圓二色譜32-33
• 2.3.10 測定Mcl-1蛋白核磁圖譜33-34
• 2.4 結(jié)果和討論34-46
• 2.4.1 基因的克隆結(jié)果分析34-35
• 2.4.2 目的蛋白的表達(dá)與結(jié)果分析35-42
• 2.4.3 Mcl-1蛋白的定量42-43
• 2.4.4 Mcl-1蛋白的定性分析43-46
• 2.5 本章小結(jié)46-47
• 3 BH3 mimetics與Mcl-1蛋白的結(jié)合模式與分子優(yōu)化的研究47-62
• 3.1 引言47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分47-49
• 3.2.1 熒光偏振47-48
• 3.2.2 分子對接48-49
• 3.2.3 ~1H-~(15)N HSQC二維核磁49
• 3.3 結(jié)果分析49-60
• 3.3.1 C1與Mcl-1蛋白作用模式的研究49-50
• 3.3.2 基于二維核磁指導(dǎo)的小分子抑制劑的優(yōu)化50-60
• 3.4 本章小結(jié)60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林克江,尤啟冬,林東海,吳梧桐,葉波平;藥物設(shè)計(jì)中的生物核磁共振技術(shù)[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報;2004年05期

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本文編號：582245