本文關(guān)鍵詞：重組人內(nèi)皮抑素、轉(zhuǎn)鐵蛋白膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒初步研究

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【摘要】：內(nèi)皮抑素作為已知的腫瘤血管生成抑制劑,可以用于實體腫瘤的治療。目前臨床上內(nèi)皮抑素濃度的檢測主要采用ELISA方法,但該方法耗時久且價格昂貴,我們希望能夠找到其它有效的方法能夠快速、方便地檢測內(nèi)皮抑素。免疫膠乳比濁法可自動化操作、重復(fù)性較好且可以減少非特異性凝集,假陽性率低。因此我們通過用重組人內(nèi)皮抑素抗體標(biāo)記合適粒徑的膠乳,以合適的吸光度變化范圍和較大的線性范圍為標(biāo)準(zhǔn)對試劑組分、檢測條件等進行調(diào)試,通過單因素實驗確定了較佳的試劑組分濃度,檢測重組人內(nèi)皮抑素標(biāo)準(zhǔn)品,組成了自制膠乳增強免疫比濁法檢測重組人內(nèi)皮抑素試劑盒。結(jié)果表明,大小均一、直徑為130 nm的膠乳與碳化二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺和內(nèi)皮抑素抗體共價結(jié)合得到致敏膠乳。致敏膠乳的最佳濃度為0.3%,波長為510 nm條件下檢測,PEG 6000用量為2.5%,樣品加樣量為8 μL,防腐劑選擇0.05% NaN_3,R1試劑與樣品反應(yīng)5 min后加入致敏膠乳后37℃反應(yīng)10 min進行檢測,檢測到的吸光度值變化范圍大且區(qū)分度好。轉(zhuǎn)鐵蛋白在抗菌、殺菌以及腫瘤和癌癥防治等方面有突出的作用。為了能夠更方便地檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度,希望能夠研制出膠乳增強免疫比濁法檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑盒。本研究以含轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的質(zhì)粒為模板用PCR方法擴增目的基因,用Xho ⅠNde Ⅰ分別對目的基因及表達(dá)載體pET28a進行雙酶切獲得目的片段和線性質(zhì)粒。在T4連接酶作用下連接,構(gòu)建成含轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的表達(dá)載體,為轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)純化、制備抗體及試劑盒的制備提供了條件。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)皮抑素 膠乳增強免疫比濁法 轉(zhuǎn)鐵蛋白 載體構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• 英文摘要5-10
• 第一章 綜述10-27
• 1. 腫瘤血管靶向治療的進展10-11
• 2. 內(nèi)皮抑素的發(fā)現(xiàn)11-12
• 3. 內(nèi)皮抑素的生物學(xué)結(jié)構(gòu)12
• 4. 內(nèi)皮抑素的分布12-13
• 5. 內(nèi)皮抑素的生物學(xué)功能13-14
• 5.1 內(nèi)皮抑素抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移作用13
• 5.2 內(nèi)皮抑素對新生血管生成的抑制作用13
• 5.3 內(nèi)皮抑素對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用,促進腫瘤細(xì)胞凋亡13-14
• 6. 內(nèi)皮抑素的作用機制14-16
• 7. 內(nèi)皮抑素存在的問題16-17
• 8. 恩度(endostar)17-19
• 9. 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)19-21
• 參考文獻21-27
• 第二章 人內(nèi)皮抑素膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒27-44
• 1. 引言27
• 2. 材料和方法27-32
• 2.1 材料27-28
• 2.2 方法28-32
• 3. 結(jié)果與分析32-41
• 3.1 ELISA檢測重組人內(nèi)皮抑素抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線32
• 3.2 膠乳原液稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線32-33
• 3.3 膠乳顆粒粒徑的選擇33-34
• 3.4 膠乳濃度的選擇34-35
• 3.5 波長的選擇35-37
• 3.6 不同加樣量的比較37
• 3.7 不同反應(yīng)時間的比較37-38
• 3.8 PEG6000與PEG2000的比較38
• 3.9 PEG6000濃度的選擇38-39
• 3.10 NaN_3與PC 300的比較39
• 3.11 HITACHI 7060全自動生化分析儀檢測39-40
• 3.12 膠乳增強免疫比濁法檢測重組人內(nèi)皮抑素試劑盒40
• 3.13 酵母表達(dá)的重組人內(nèi)皮抑素濃度的檢測40-41
• 4. 討論41-43
• 參考文獻43-44
• 第三章 轉(zhuǎn)鐵蛋白膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒的初步研究44-58
• 1. 引言44
• 2. 材料、試劑和方法44-51
• 2.1 材料44
• 2.2 主要試劑44-45
• 2.3 主要儀器45
• 2.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建45-51
• 3. 結(jié)果51-56
• 3.1 Tf基因PCR電泳結(jié)果51
• 3.2 pET28a質(zhì)粒及TfPCR模板質(zhì)粒電泳結(jié)果51-52
• 3.3 Tf基因PCR產(chǎn)物酶切、pET28a質(zhì)粒酶切52
• 3.4 重組質(zhì)粒的鑒定52-56
• 4. 討論56-57
• 參考文獻57-58
• 第四章 依諾沙星抗腫瘤新適應(yīng)癥研究58-69
• 1. 引言58-59
• 2. 材料方法59-65
• 2.1 材料59-60
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)60
• 2.3 CCK-8檢測依諾沙星對細(xì)胞活力的影響60-61
• 2.4 siRNA的轉(zhuǎn)染61-62
• 2.5 細(xì)胞總RNA的提取62-63
• 2.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)63
• 2.7 熒光定量PCR(qPCR)63-65
• 3. 結(jié)果65-67
• 3.1 CCK-8檢測依諾沙星對BGC-803,HB2細(xì)胞活力的影響效果65-66
• 3.2 BGC-803細(xì)胞VEGF-mRNA、HB2細(xì)胞bcl-2-mRNA相對表達(dá)量66-67
• 4. 討論67-68
• 參考文獻68-69
• 附錄69-70
• 致謝70-71

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