本文關鍵詞：重組人內皮抑素、轉鐵蛋白膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒初步研究

  更多相關文章： 內皮抑素 膠乳增強免疫比濁法 轉鐵蛋白 載體構建

【摘要】：內皮抑素作為已知的腫瘤血管生成抑制劑,可以用于實體腫瘤的治療。目前臨床上內皮抑素濃度的檢測主要采用ELISA方法,但該方法耗時久且價格昂貴,我們希望能夠找到其它有效的方法能夠快速、方便地檢測內皮抑素。免疫膠乳比濁法可自動化操作、重復性較好且可以減少非特異性凝集,假陽性率低。因此我們通過用重組人內皮抑素抗體標記合適粒徑的膠乳,以合適的吸光度變化范圍和較大的線性范圍為標準對試劑組分、檢測條件等進行調試,通過單因素實驗確定了較佳的試劑組分濃度,檢測重組人內皮抑素標準品,組成了自制膠乳增強免疫比濁法檢測重組人內皮抑素試劑盒。結果表明,大小均一、直徑為130 nm的膠乳與碳化二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺和內皮抑素抗體共價結合得到致敏膠乳。致敏膠乳的最佳濃度為0.3%,波長為510 nm條件下檢測,PEG 6000用量為2.5%,樣品加樣量為8 μL,防腐劑選擇0.05% NaN_3,R1試劑與樣品反應5 min后加入致敏膠乳后37℃反應10 min進行檢測,檢測到的吸光度值變化范圍大且區(qū)分度好。轉鐵蛋白在抗菌、殺菌以及腫瘤和癌癥防治等方面有突出的作用。為了能夠更方便地檢測轉鐵蛋白濃度,希望能夠研制出膠乳增強免疫比濁法檢測轉鐵蛋白試劑盒。本研究以含轉鐵蛋白基因的質粒為模板用PCR方法擴增目的基因,用Xho ⅠNde Ⅰ分別對目的基因及表達載體pET28a進行雙酶切獲得目的片段和線性質粒。在T4連接酶作用下連接,構建成含轉鐵蛋白基因的表達載體,為轉鐵蛋白表達純化、制備抗體及試劑盒的制備提供了條件。
【關鍵詞】：內皮抑素 膠乳增強免疫比濁法 轉鐵蛋白 載體構建
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• 英文摘要5-10
• 第一章 綜述10-27
• 1. 腫瘤血管靶向治療的進展10-11
• 2. 內皮抑素的發(fā)現(xiàn)11-12
• 3. 內皮抑素的生物學結構12
• 4. 內皮抑素的分布12-13
• 5. 內皮抑素的生物學功能13-14
• 5.1 內皮抑素抑制內皮細胞增殖、遷移作用13
• 5.2 內皮抑素對新生血管生成的抑制作用13
• 5.3 內皮抑素對腫瘤的生長和轉移的抑制作用,促進腫瘤細胞凋亡13-14
• 6. 內皮抑素的作用機制14-16
• 7. 內皮抑素存在的問題16-17
• 8. 恩度(endostar)17-19
• 9. 血管內皮生長因子(VEGF)和血管內皮生長因子受體(VEGFR)19-21
• 參考文獻21-27
• 第二章 人內皮抑素膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒27-44
• 1. 引言27
• 2. 材料和方法27-32
• 2.1 材料27-28
• 2.2 方法28-32
• 3. 結果與分析32-41
• 3.1 ELISA檢測重組人內皮抑素抗體的標準曲線32
• 3.2 膠乳原液稀釋標準曲線32-33
• 3.3 膠乳顆粒粒徑的選擇33-34
• 3.4 膠乳濃度的選擇34-35
• 3.5 波長的選擇35-37
• 3.6 不同加樣量的比較37
• 3.7 不同反應時間的比較37-38
• 3.8 PEG6000與PEG2000的比較38
• 3.9 PEG6000濃度的選擇38-39
• 3.10 NaN_3與PC 300的比較39
• 3.11 HITACHI 7060全自動生化分析儀檢測39-40
• 3.12 膠乳增強免疫比濁法檢測重組人內皮抑素試劑盒40
• 3.13 酵母表達的重組人內皮抑素濃度的檢測40-41
• 4. 討論41-43
• 參考文獻43-44
• 第三章 轉鐵蛋白膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒的初步研究44-58
• 1. 引言44
• 2. 材料、試劑和方法44-51
• 2.1 材料44
• 2.2 主要試劑44-45
• 2.3 主要儀器45
• 2.4 轉鐵蛋白表達質粒的構建45-51
• 3. 結果51-56
• 3.1 Tf基因PCR電泳結果51
• 3.2 pET28a質粒及TfPCR模板質粒電泳結果51-52
• 3.3 Tf基因PCR產(chǎn)物酶切、pET28a質粒酶切52
• 3.4 重組質粒的鑒定52-56
• 4. 討論56-57
• 參考文獻57-58
• 第四章 依諾沙星抗腫瘤新適應癥研究58-69
• 1. 引言58-59
• 2. 材料方法59-65
• 2.1 材料59-60
• 2.2 細胞培養(yǎng)60
• 2.3 CCK-8檢測依諾沙星對細胞活力的影響60-61
• 2.4 siRNA的轉染61-62
• 2.5 細胞總RNA的提取62-63
• 2.6 逆轉錄PCR(RT-PCR)63
• 2.7 熒光定量PCR(qPCR)63-65
• 3. 結果65-67
• 3.1 CCK-8檢測依諾沙星對BGC-803,HB2細胞活力的影響效果65-66
• 3.2 BGC-803細胞VEGF-mRNA、HB2細胞bcl-2-mRNA相對表達量66-67
• 4. 討論67-68
• 參考文獻68-69
• 附錄69-70
• 致謝70-71

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李思維,尹宜發(fā),鄒立勇,胡遠強;內皮抑素的研究現(xiàn)狀及其進展[J];醫(yī)學綜述;2005年07期

2 夏紅強;樓谷音;;內皮抑素臨床研究新進展[J];中國藥房;2007年08期

3 靳晨亭;陸蕙;;內皮抑素及其與心血管病的關系[J];國際心血管病雜志;2008年04期

4 肖芳芳;黃宇戈;;內皮抑素與肺發(fā)育關系的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2010年09期

5 俞英欣,劉瑞,趙德化,劉俊山;內皮抑素的抗腫瘤作用展望[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);2000年05期

6 ;內皮抑素轉基因雙歧桿菌抑癌效果觀察[J];南京軍醫(yī)學院學報;2000年03期

7 馮怡;內皮抑素研究進展[J];生物工程學報;2001年05期

8 劉文華,董文度,徐根興,劉新卷,傅更鋒,張敏華,駱云,樊燕蓉,MA Jin-ping,LI Jie,REN Min-dong;口服轉內皮抑素基因雙歧桿菌制劑對肺癌的療效[J];南京軍醫(yī)學院學報;2001年02期

9 徐立春,陳志琳,張育,孫振華,陳平,劉曉丹,卜平;抗腫瘤的人重組內皮抑素基因的克隆及表達[J];中國自然醫(yī)學雜志;2002年04期

10 王朱逸,王瑤;內皮抑素抗腫瘤作用研究進展[J];同濟大學學報(醫(yī)學版);2003年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李永紅;張翊;繞春明;王軍志;;內皮細胞遷移法定量測定內皮抑素生物學活性的研究[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2001年

2 許煥麗;王鳳山;;內皮抑素的結構與作用機制研究進展[A];山東省藥學會2006年生化與生物技術藥物學術研討會論文集[C];2006年

3 譚海寧;王鳳山;凌沛學;;內皮抑素及其對血管生成抑制作用的研究進展[A];山東省藥學會2006年生化與生物技術藥物學術研討會論文集[C];2006年

4 譚海寧;王鳳山;;內皮抑素的硫酸肝素修飾及二級結構與活性研究[A];中國藥學會全國多糖類藥物研究與應用研討會論文集[C];2008年

5 譚海寧;王鳳山;凌沛學;;內皮抑素及其對多種腫瘤抑制作用的研究進展[A];山東省藥學會第一屆學術年會論文集（上）[C];2005年

6 高慧棋;楊志杰;李勇;;內皮抑素基因聯(lián)合~(32)P膠體對大鼠種植癌的抑制作用[A];第四屆全國中青年核醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2008年

7 馮怡;許偉利;馬清鈞;;人ANG-EN1融合蛋白表達載體的構建及在大腸桿菌中表達的研究[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2001年

8 王東之;毛威;戴金;黃兆銓;陳民利;倪桂寶;;內皮抑素對動脈粥樣硬化的作用及其機制研究[A];第十三次全國心血管病學術會議論文集[C];2011年

9 申寶忠;黃濤;王凱;王可錚;李任飛;張同;王丹;;光學分子成像監(jiān)測內皮抑素基因治療肺癌的實驗研究[A];中華醫(yī)學會第16次全國放射學學術大會論文匯編[C];2009年

10 季怡萍;夏敏;王群;;MALDI-TOF-MS法對重組人內皮抑素蛋白分子質量測定[A];2004年全國有機質譜學術交流會論文集[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李思維；班麗麗;內皮抑素治療腫瘤喜中有憂[N];中國醫(yī)藥報;2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 隋剛;腺病毒介導內皮抑素基因治療小鼠肺癌的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2004年

2 馮玉梅;內皮抑素及其噬菌體模擬肽抑制新血管形成研究[D];重慶醫(yī)科大學;2005年

3 楊珉;內皮抑素治療膠質瘤的作用機制研究[D];華中科技大學;2007年

4 劉曉強;內皮抑素重組腺病毒載體的構建及其對膀胱癌生長抑制作用的研究[D];天津醫(yī)科大學;2003年

5 王曉燕;重組內皮抑素及重組α-干擾素在抑制角膜新生血管生成及腫瘤中的應用研究[D];山東大學;2004年

6 段薇;葡萄糖對血管內皮細胞內皮抑素表達的影響及其調控機制的研究[D];中國醫(yī)科大學;2007年

7 凌春華;內皮抑素基因轉移聯(lián)合電離輻射對肺腺癌的實驗性治療及相關臨床研究[D];蘇州大學;2003年

8 于音;內皮抑素基因聯(lián)合骨髓間充質干細胞治療大鼠腦膠質瘤的實驗研究[D];吉林大學;2008年

9 陳雄;攜帶內皮抑素基因增殖型腺病毒治療卵巢癌的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

10 牛牛;聯(lián)合用藥在肺癌抗血管治療中的療效及毒副作用分析[D];北京市結核病胸部腫瘤研究所;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 于曉瑋;內皮抑素膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒和糖化白蛋白酶法檢測試劑盒的研究[D];南京大學;2015年

2 徐榕苑;內皮抑素聯(lián)合放療治療宮頸癌的研究進展[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

3 王焱;重組人內皮抑素、轉鐵蛋白膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒初步研究[D];南京大學;2014年

4 綦霞;小鼠內皮抑素基因突變體的構建及其功能的初步研究[D];大連醫(yī)科大學;2004年

5 黃曉華;小鼠內皮抑素基因突變體的克隆表達及功能的初步研究[D];大連醫(yī)科大學;2005年

6 李招娜;低分子肝素化內皮抑素抑制兔角膜新生血管的實驗研究[D];山東大學;2005年

7 宋霞;內皮抑素基因非病毒載體肌肉注射聯(lián)合電脈沖體內轉染的研究[D];山西醫(yī)科大學;2005年

8 李超鵬;人內皮抑素重組腺病毒轉染人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外實驗[D];四川大學;2006年

9 邵杰;內皮抑素對膠質瘤細胞增殖的影響研究[D];蘇州大學;2012年

10 朱偉;內皮抑素及其修飾物對脈絡膜新生血管抑制作用的實驗研究[D];山東大學;2008年

，

本文編號：565769