本文關(guān)鍵詞：PLIγ重組表達(dá)載體構(gòu)建及其抗LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥作用

  更多相關(guān)文章： 分泌型磷脂酶A2 PLIγ 慢病毒感染 THP-1細(xì)胞 抗炎癥

【摘要】：分泌型磷脂酶A2（Secretory Phospholipase A2,sPLA2）是花生四烯酸（AA）代謝通路的上游關(guān)鍵酶，sPLA2的激活導(dǎo)致AA水平升高，進(jìn)而產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)，例如前列腺素、白三烯、血栓烷A等。因此，sPLA2的高表達(dá)可導(dǎo)致多種炎性疾病，例如胰腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等，sPLA2也是以上多種疾病藥物治療的重要靶點(diǎn)。 自然界中sPLA2在蛇毒中分泌最為廣泛，蛇毒中毒患者也常有全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）和組織壞死的癥狀。我們實(shí)驗(yàn)室前期從華游蛇（Sinonatrixannularis）——一種中國(guó)的無毒蛇中，分離到蛇毒sPLA2(svPLA2)的γ型抑制蛋白（phospholipae A2inhibitor, PLIγ）。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)這種PLIγ有良好的抗蛇毒PLA2出血毒作用。此外，與蛇毒PLA2與人sPLA2結(jié)構(gòu)高度相似，分類上屬于相同的亞型。因此，PLIγ能否阻斷人類sPLA2，并可能對(duì)花生四烯酸（AA）介導(dǎo)的炎癥發(fā)揮抑制作用，這個(gè)問題引起了我們的研究興趣。鑒于此，我們克隆了PLIγ基因，并將其導(dǎo)入THP-1細(xì)胞中，評(píng)價(jià)PLIγ對(duì)LPS誘導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞炎癥的作用。 目的： 為了研究體內(nèi)PLIγ在細(xì)胞水平的抗炎癥作用，我們構(gòu)建PLIγ重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人THP-1細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中sPLA2亞型，從而闡明其與炎癥反應(yīng)相關(guān)的sPLA2亞型，同時(shí)檢測(cè)一些典型的促炎因子如AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF表達(dá)水平，通過LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，探討PLIγ的抗炎活性。 方法： 設(shè)計(jì)分別含有EcoRI，BamHI酶切位點(diǎn)的上下游引物，通過RT-PCR克隆華游蛇PLIγ基因。PCR產(chǎn)物和pIRES2-EGFP載體經(jīng)過酶切、凝膠回收和T4酶連接，構(gòu)建pIRES2-EGFP-PLIγ重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化入DH5α菌保存，通過EcoRI，BamHI雙酶切鑒定重組載體。重組載體通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人THP-1細(xì)胞，于顯微鏡下觀察GFP綠色熒光的表達(dá)，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。 由于轉(zhuǎn)染效率較低，且重組質(zhì)粒在THP-1細(xì)胞有絲分裂過程中容易丟失，，因此，該質(zhì)粒不適合后續(xù)的功能試驗(yàn)。為了保證PLIγ在THP-1的穩(wěn)定表達(dá)，我們轉(zhuǎn)而采用慢病毒載體系統(tǒng)。我們將PLIγ基因與含有3個(gè)Flag序列的標(biāo)簽融合表達(dá)，生成慢病毒載體PGC-FU-PLIγ-EGFP。將該重組病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得有感染能力的重組慢病毒LV-PLIγ-EGFP。重組蛋白PLIγ-3Flag的表達(dá)情況由western blot檢測(cè)。 將病毒LV-PLIγ-EGFP感染THP-1細(xì)胞，通過GFP熒光率評(píng)價(jià)感染效率。THP-1細(xì)胞分為三組：正常細(xì)胞組（control組）、PLIγ陰性組（該組僅轉(zhuǎn)染LV-EGFP，也稱mock組）、PLIγ陽性組（該組轉(zhuǎn)染LV-PLIγ-EGFP，也稱PLIγ組）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將1μg/ml LPS孵育各組THP-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置與各組相對(duì)應(yīng)的不加LPS的平行組。Real-time PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞中sPLA2各亞型，采用ELISA法檢測(cè)AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等炎癥因子表達(dá)水平，WST-1法研究各組THP-1細(xì)胞的增殖。 結(jié)果： 成功構(gòu)建了pIRES2-EGFP-PLIγ的真核表達(dá)質(zhì)粒，但由于該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性都較低，不能滿足后續(xù)功能試驗(yàn)要求。通過熒光顯微鏡觀察和Western blot檢測(cè)，本文構(gòu)建的慢病毒系統(tǒng)能高效、穩(wěn)定地表達(dá)GFP綠色熒光和PLIγ。 在LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥過程中，我們發(fā)現(xiàn)兩種sPLA2亞型（IIF和X）及六種炎癥因子表達(dá)顯著上調(diào)。相對(duì)于正常組THP-1細(xì)胞，病毒轉(zhuǎn)染組（PLIγ組和mock組）細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量更高。更重要的是，PLIγ組相對(duì)于mock組，其六種炎癥因子的表達(dá)水平更低。WST-1實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常組THP-1細(xì)胞，病毒轉(zhuǎn)染組（PLIγ組和mock組）細(xì)胞增殖速度略慢，不過PLIγ組相對(duì)于mock組細(xì)胞增殖速度略快。 結(jié)論: 重組慢病毒系統(tǒng)可以穩(wěn)定、高效地表達(dá)異源基因，如本文中的PLIγ基因。PLIγ的存在可以顯著降低AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等六種炎癥因子表達(dá)。由于IIF和X型sPLA2在LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，說明PLIγ很可能是通過抑制這兩種sPLA2的激活而發(fā)揮抗炎癥作用。此外，PLIγ不會(huì)影響細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：分泌型磷脂酶A2 PLIγ 慢病毒感染 THP-1細(xì)胞 抗炎癥
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-14
• 1. sPLA_2與炎癥11-12
• 2. PLIγ與抗炎12-13
• 3. 本文研究目的13-14
• 第2章 華游蛇 PLIγ真核表達(dá)載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染14-24
• 1. 材料、試劑和儀器14-16
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 2.1 PCR克隆華游蛇 PLI 基因16-17
• 2.2 構(gòu)建 TA克隆質(zhì)粒 pGEM-T/PLIγ17-18
• 2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-PLIγ18-19
• 2.4 pIRES2-EGFP-PLIγ轉(zhuǎn)染 THP-1 細(xì)胞19-20
• 3 結(jié)果與分析20-22
• 3.1 華游蛇 PLIγ的擴(kuò)增與電泳鑒定20-21
• 3.2 重組質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-PLIγ的酶切產(chǎn)物鑒定21
• 3.3 重組質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-PLIγ測(cè)序鑒定21-22
• 3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果22
• 4 小結(jié)與討論22-24
• 第3章 慢病毒重組載體 PGC-FU-PLIγ-EGFP 的構(gòu)建及病毒感染 THP-1 細(xì)胞24-34
• 1 材料試劑和儀器24-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.1 PGC-FU-PLIγ-EGFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增和鑒定25-26
• 2.2 慢病毒 LV-PLIγ-EGFP 表達(dá)檢測(cè)26-27
• 2.3 慢病毒 LV-PLIγ-EGFP 感染 THP-1 細(xì)胞27-28
• 3 結(jié)果與分析28-32
• 3.1 慢病毒重組載體 PGC-FU-PLIγ-EGFP 鑒定結(jié)果28-30
• 3.2 慢病毒載體 PGC-FU-PLIγ-EGFP 中 PLIγ表達(dá)情況30-31
• 3.3 病毒 LV-PLIγ-EGFP 感染 THP-1 效率觀察31-32
• 3.4 THP-1 細(xì)胞中 PLIγ表達(dá)穩(wěn)定性32
• 4 討論32-34
• 第4章 PLIγ抑制 LPS 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞炎癥作用34-47
• 1. 材料試劑和儀器34
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 2.1 LPS 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞炎癥實(shí)驗(yàn)34-35
• 2.2 Real-time PCR方法檢測(cè) sPLA_2抑制水平35-36
• 2.3 ELISA 方法檢測(cè) THP-1 細(xì)胞上清中各類炎癥因子的含量36-37
• 2.4 LPS 誘導(dǎo)及 PLIγ對(duì) THP-1 細(xì)胞增殖的影響37
• 2.5 統(tǒng)計(jì)處理37-38
• 3. 結(jié)果與分析38-43
• 3.1 THP-1 細(xì)胞 sPLA_2亞型表達(dá)情況38
• 3.2 Real timePCR 檢測(cè) sPLA_2-IIF 和 sPLA_2-X 表達(dá)38-40
• 3.3 PLIγ對(duì) THP-1 細(xì)胞分泌炎癥因子的影響40-41
• 3.4 LPS 誘導(dǎo)及 PLIγ對(duì) THP-1 細(xì)胞增殖的影響41-43
• 4. 討論43-47
• 4.1 人類炎癥相關(guān)的 sPLA_243-44
• 4.2 sPLA_2與相關(guān)炎癥因子44-45
• 4.3 特異性的 sPLA_2抑制劑45-47
• 第5章 全文總結(jié)47-48
• 結(jié)論與下一步工作計(jì)劃48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果54-55
• 綜述55-65
• 參考文獻(xiàn)62-65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 鐘立鵬;郭薇;姚敏;沈婷;楊武;黃春洪;;華游蛇PLIγ模擬肽的設(shè)計(jì)與活性驗(yàn)證[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年03期

2 楊武;郭薇;黃春洪;;分泌型磷脂酶A_2亞家族:結(jié)構(gòu)與功能[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年10期

本文編號(hào)：564319