本文關(guān)鍵詞：Robo2調(diào)控小鼠腎臟發(fā)育信號通路機(jī)制的研究

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【摘要】：目的：腎臟發(fā)育缺陷可導(dǎo)致嚴(yán)重的泌尿系統(tǒng)結(jié)構(gòu)缺陷以及功能異常。有研究發(fā)現(xiàn)Robo2異常表達(dá)可導(dǎo)致輸尿管芽分支減少、腎小球數(shù)目減少、足細(xì)胞病變等缺陷,但其調(diào)控腎臟發(fā)育的信號機(jī)制并不清楚。本研究通過對比Robo2基因敲除和野生型小鼠胚腎信使R NA (mRNA)表達(dá)差異,篩選小鼠發(fā)育過程中與Robo2相互作用的蛋白,并驗(yàn)證篩選的蛋白與Robo2相互作用關(guān)系以及在腎臟發(fā)育過程中的作用,最終確定Robo2調(diào)控后腎間充質(zhì)與輸尿管芽發(fā)育的關(guān)鍵信號分子,明確其調(diào)控腎臟發(fā)育的信號分子作用途經(jīng)。方法：(1)顯微分離胚齡E14.5d的Robo2純合子和野生型胚鼠腎臟,提取RNA,進(jìn)行RNA-Seq測序,對比Robo2純合子和野生型胚鼠腎臟中的mRNA差異,并選取差異顯著的基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。(2)顯微分離胚齡E13.5d的ICR胚鼠腎臟,提取蛋白,利用Robo2單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀后,收集蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,質(zhì)譜分析并篩選與Robo2可能相互作用的蛋白。(3)驗(yàn)證篩選的視黃醛合成酶(Aldh1a2)與Robo2的相互作用：顯微分離胚齡E12.5d、E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E17.5d、E18.5d胚鼠腎臟和出生后日齡P7d、P14d、P21d、P35d小鼠腎臟,冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色觀察Aldh1a2在小鼠腎臟發(fā)育各階段的表達(dá)部位；提取蛋白進(jìn)行Western Blot分析Aldhla2在小鼠腎臟發(fā)育各階段的表達(dá)量的變化；孕鼠食用過量視黃酸后觀察胚鼠腎臟的表型變化。結(jié)果：(1)通過對Robo2純合子和野生型胚腎進(jìn)行RNA-Seq測序分析,有20872個(gè)基因表達(dá)量存在差異,分析了Robo2-/-小鼠腎臟基因表達(dá)分布比率并繪制了Robo2在小鼠腎臟的可能分子信號網(wǎng)絡(luò),RT-PCR驗(yàn)證了胚腎野生型和純合子相比,Klc1、Clta、Pomgnt1、Fhl1、Robo2、Abi1的表達(dá)量差異超過20倍。(2)質(zhì)譜分析可能參與Robo2調(diào)控后腎間充質(zhì)與輸尿管芽發(fā)育的25種蛋白：Aldh1a2、Rob o1等。(3)腎臟發(fā)育過程中Aldh1a2的表達(dá)變化：①Western Blot結(jié)果顯示,Aldh1a2在發(fā)育的E12.5d-E15.5d表達(dá)水平最高,隨后水平明顯下降,在出生后呈現(xiàn)低水平表達(dá)。②免疫熒光染色結(jié)果顯示,Aldhla2在腎臟發(fā)育過程主要表達(dá)于后腎間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞和少數(shù)帽狀間充質(zhì)細(xì)胞,而不在輸尿管芽表達(dá)。隨著胚齡增加及腎臟發(fā)育,在E14.5d后逐漸表達(dá)于腎小管前體細(xì)胞、逗號形體和“S”形體、早期的近端小管上皮細(xì)胞、腎小球包曼氏囊壁層上皮細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞。在出生后35天,腎臟發(fā)育成熟時(shí)Aldh1a2在上述部位消失。③孕鼠喂食視黃酸后胚腎和輸尿管發(fā)育異常,腎臟體積減小,腎臟腎盂擴(kuò)張,輸尿管彎曲擴(kuò)張畸形,輸尿管與腎臟連接異常,輸尿管與膀胱連接異常,還可出現(xiàn)“馬蹄腎”畸形。結(jié)論：Robo2基因敲除后,Klc1、Clta、Pomgnt1、Fhl1及Abil等基因表達(dá)水平明顯降低,提示Robo2對它們在腎臟發(fā)育過程中具有正調(diào)控作用,參與了Robo2的分子信號通路；質(zhì)譜分析篩選出25種可能與Robo2相互作用的Aldhla2、Robo1等蛋白,從分布、表型等驗(yàn)證了Aldh1a2可能是其關(guān)鍵信號分子,孕鼠喂食過量視黃酸后導(dǎo)致胚鼠腎臟和輸尿管擴(kuò)張畸形。
【關(guān)鍵詞】：Robo2 腎臟發(fā)育 信號分子 Aldh1a2
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R334.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-13
• 第1章 引言13-17
• 1.1 腎臟發(fā)育及其在泌尿系統(tǒng)疾病防治中的地位13-14
• 1.2 Robo2的分子結(jié)構(gòu)以及Slit2/Robo2信號通路14-15
• 1.3 Robo2與腎臟發(fā)育的關(guān)系15-16
• 1.3.1 Robo2在腎臟的表達(dá)15
• 1.3.2 Robo2對腎臟發(fā)育的影響15-16
• 1.4 本課題的研究內(nèi)容16-17
• 第2章 Robo2基因敲除和野生型小鼠胚腎mRNA差異17-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑和儀器17-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑17
• 2.1.3 主要儀器17-18
• 2.1.4 其他18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及標(biāo)本留取18
• 2.2.2 Robo2基因敲除小鼠的基因型鑒定18-20
• 2.2.3 RNA提取和cDNA合成20-21
• 2.2.4 RNA-Seq測序21-22
• 2.2.5 IPA軟件分析Robo2信號網(wǎng)絡(luò)22
• 2.2.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測22-24
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-30
• 2.3.1 RNA-Seq測序結(jié)果24-25
• 2.3.2 IPA數(shù)據(jù)分析25-27
• 2.3.3 RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果27-30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第3章 小鼠腎臟發(fā)育過程中與Robo2相互作用的蛋白32-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑和儀器設(shè)備32-33
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑32-33
• 3.1.3 主要儀器33
• 3.1.4 其他33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-37
• 3.2.1 免疫共沉淀33-34
• 3.2.2 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝膠電泳分離蛋白34-35
• 3.2.3 銀染及脫色35-36
• 3.2.4 膠內(nèi)酶解36-37
• 3.2.5 2D-LC/MS檢測37
• 3.2.6 生物信息學(xué)分析37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 3.3.1 與Robo2相互作用的蛋白質(zhì)37-38
• 3.3.2 蛋白質(zhì)的功能分析38-41
• 3.3.2.1 String9.05軟件分析蛋白質(zhì)38-40
• 3.3.2.2 IPA軟件分析蛋白質(zhì)40-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 第4章 小鼠胚腎發(fā)育過程Robo2與Aldh1a2的相互關(guān)系43-65
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑和儀器設(shè)備43-45
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物43
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑43-44
• 4.1.3 主要儀器44
• 4.1.4 其他44-45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法45-48
• 4.2.1 構(gòu)建視黃酸過量孕鼠模型45
• 4.2.2 冰凍組織留取及冰凍切片免疫熒光染色45-46
• 4.2.3 石蠟組織留取及石蠟HE染色46
• 4.2.4 Wtem Blot檢測蛋白表達(dá)46-48
• 4.2.5 胚腎體外培養(yǎng)及免疫熒光染色48
• 4.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-61
• 4.3.1 Robo2與Aldh1a2在胚腎的免疫熒光染色48-49
• 4.3.2 Aldh1a2在小鼠胚腎發(fā)育各階段蛋白表達(dá)情況49-50
• 4.3.3 Aldh1a2在小鼠胚腎發(fā)育各階段免疫熒光染色結(jié)果50-57
• 4.3.4 孕鼠喂食視黃酸后胚腎和輸尿管發(fā)育異常57-61
• 4.4 討論61-63
• 4.5 小結(jié)63-65
• 第5章 全文總結(jié)65-66
• 致謝66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 附錄實(shí)驗(yàn)所需主要試劑配制70-72
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果72-73
• 綜述73-85
• 參考文獻(xiàn)81-85

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周昱;夏正坤;;腎臟發(fā)育與腎臟疾病的發(fā)生[J];發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志;2015年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳大鵬;miR-34a調(diào)控系膜增殖性腎炎的機(jī)制研究[D];南開大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 宋東建;小兒腎母細(xì)胞瘤中P73和SIX2基因的表達(dá)及甲基化相關(guān)性研究[D];鄭州大學(xué);2013年

2 周普輝;Nf1在腎臟發(fā)育過程中的作用及其機(jī)理[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號：562954