本文關(guān)鍵詞：重組人轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及人巨細(xì)胞病毒IgG抗體國(guó)家參考品的研制

  更多相關(guān)文章： 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 谷草轉(zhuǎn)氨酶 標(biāo)準(zhǔn)品 人巨細(xì)胞病毒 IgG抗體 參考品盤

【摘要】：目的 通過(guò)采用基因重組的技術(shù)表達(dá)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白研制人谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶混合標(biāo)準(zhǔn)品，用于臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒的質(zhì)量控制。通過(guò)以正常人的血清為原料研制人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品，用于臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室和人巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量控制。 方法 一、重組人轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制 1、目的基因的獲得。從NCBI網(wǎng)站上查詢?nèi)斯缺D(zhuǎn)氨酶蛋白和人谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白的序列，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子表，對(duì)查找的序列進(jìn)行優(yōu)化，并將優(yōu)化成功的基因序列送生物公司合成。 2、表達(dá)菌株構(gòu)建。通過(guò)雙酶切的方法將合成的基因從復(fù)制型載體上切下，連接入表達(dá)載體PRSF-Duet，構(gòu)建出表達(dá)載體PRSF-ALT和PRSF-AST，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，構(gòu)建出基因工程菌株。 3、蛋白的表達(dá)、純化及活性測(cè)定。用IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，對(duì)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中所需的IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行探索，并對(duì)表達(dá)的蛋白通過(guò)親和層析和分子篩層析的方法進(jìn)行純化，獲得人谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和人谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白，并對(duì)獲得的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白進(jìn)行活性測(cè)定。 4、基質(zhì)血清的處理。對(duì)收集的正常人血清進(jìn)行血源篩查后，對(duì)合格血清進(jìn)行去纖維化處理以制備轉(zhuǎn)氨酶的基質(zhì)。 5、標(biāo)準(zhǔn)品的制備。將制備的谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白按一定濃度加入基質(zhì)血清中，混勻，并分裝至1.5mL的凍存管中完成標(biāo)準(zhǔn)品的制備。 6、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。同時(shí)用3份轉(zhuǎn)氨濃度不同的血清和生理鹽水對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，將稀釋后的樣品進(jìn)行測(cè)定。統(tǒng)計(jì)分析測(cè)定結(jié)果。 7、標(biāo)準(zhǔn)品的評(píng)價(jià)。對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。 8、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值以及不確定度的評(píng)估。將研制的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過(guò)三家轉(zhuǎn)氨酶參考實(shí)驗(yàn)室，用IFCC參考方法對(duì)轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值。對(duì)研制的轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度進(jìn)行評(píng)估。 二、人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品的研制 9、參考品原料的獲得。將收集的血漿進(jìn)行去纖維化處理并進(jìn)行血源篩查試驗(yàn)，用人巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)收集的血清進(jìn)行篩選，篩選出10份人巨細(xì)胞病毒IgG抗體陽(yáng)性血清和5份人巨細(xì)胞病毒IgG抗體陰性血清。 10、參考品原料的確認(rèn)和復(fù)核。用間接免疫熒光和Westernblot的方法對(duì)參考品原料進(jìn)行確認(rèn)，用國(guó)內(nèi)外的試劑盒對(duì)參考品原料進(jìn)行復(fù)核。 11、參考品的驗(yàn)證。用國(guó)內(nèi)外六家公司生產(chǎn)的試劑盒對(duì)制備的參考品從準(zhǔn)確性、特異性以及靈敏度三個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。 12、參考品穩(wěn)定性的考察。用人巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)參考品在不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。 結(jié)果 通過(guò)對(duì)人谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因和人谷草轉(zhuǎn)氨酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并將轉(zhuǎn)氨酶基因克隆至PRSF-Duet載體中，將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌體中，成功表達(dá)了人谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白，通過(guò)蛋白的純化得到了活性為80000U/L的谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和活性為136000U/L的谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白，將轉(zhuǎn)氨酶蛋白制成轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品均勻性良好、穩(wěn)定性良好。最后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值和不確定度評(píng)估，得出谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為1020.5U/L，不確定度為194.40U/L。谷草轉(zhuǎn)氨酶活性為792.9U/L，不確定度為78.37U/L。 用試劑盒篩選出人巨細(xì)胞病毒IgG抗體的陽(yáng)性血10份，陰性血5份，用兩家不同的試劑盒對(duì)篩選的血清進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果符合預(yù)期，用免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的血清進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果符合要求。將確認(rèn)正確的血清制成人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品盤，，并用不同公司的試劑盒對(duì)參考品盤進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果符合要求，采用人巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)參考品的盤的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果表明參考品盤的穩(wěn)定性良好。 結(jié)論 成功研制出了重組人轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品填補(bǔ)了我國(guó)重組轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品的空白，成功研制出人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品。研制的標(biāo)準(zhǔn)品和參考品可用于臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室和相關(guān)的體外診斷試劑盒的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】：谷丙轉(zhuǎn)氨酶 谷草轉(zhuǎn)氨酶 標(biāo)準(zhǔn)品 人巨細(xì)胞病毒 IgG抗體 參考品盤
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 目錄2-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 英文縮略詞14-15
• 第一章 重組人轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制15-88
• 1 概述15-17
• 1.1 轉(zhuǎn)氨酶概述15
• 1.2 臨床上轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定15-16
• 1.3 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品研制的現(xiàn)狀16
• 1.4 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的理論依據(jù)16-17
• 2 試驗(yàn)材料和方法17-42
• 2.1 試驗(yàn)材料17-22
• 2.1.1 試驗(yàn)儀器17-18
• 2.1.2 試驗(yàn)耗材18
• 2.1.3 生物材料18
• 2.1.4 工具酶和主要試劑18-20
• 2.1.5 溶液的配制20-22
• 2.2 試驗(yàn)方法22-42
• 2.2.1 目的基因的獲得22-23
• 2.2.2 基因工程表達(dá)菌株的構(gòu)建23-27
• 2.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)27-30
• 2.2.4 目的蛋白的提取與純化30-34
• 2.2.5 目的蛋白活性的測(cè)定34
• 2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基質(zhì)血清的處理34-35
• 2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備35-36
• 2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇36
• 2.2.9 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶?jī)?nèi)均勻性評(píng)價(jià)36-37
• 2.2.10 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶間均勻性評(píng)價(jià)37
• 2.2.11 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的凍融穩(wěn)定性評(píng)價(jià)37-38
• 2.2.12 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4℃儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定性評(píng)價(jià)38
• 2.2.13 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在常溫放置條件下穩(wěn)定性評(píng)價(jià)38-39
• 2.2.14 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)39
• 2.2.15 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值39-40
• 2.2.16 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定性的評(píng)估40-42
• 3 試驗(yàn)結(jié)果42-80
• 3.1 目的基因的獲得42-52
• 3.1.1 谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因的獲得42-47
• 3.1.2 谷草轉(zhuǎn)氨酶基因片段的獲得47-52
• 3.2 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果52-55
• 3.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒圖譜52-53
• 3.2.2 酶切驗(yàn)證的結(jié)果53
• 3.2.3 測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果53-55
• 3.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)55-59
• 3.3.1 蛋白質(zhì)電泳結(jié)果55-56
• 3.3.2 Westernblot驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果56-57
• 3.3.3 誘導(dǎo)條件對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響57-59
• 3.4 蛋白可溶性鑒定59-61
• 3.4.1 蛋白質(zhì)電泳結(jié)果59-60
• 3.4.2 Westernblot試驗(yàn)結(jié)果60-61
• 3.5 分子篩層析結(jié)果61-62
• 3.6 蛋白的最終鑒定62-64
• 3.6.1 蛋白質(zhì)電泳結(jié)果62-63
• 3.6.2 Westernblot試驗(yàn)結(jié)果63-64
• 3.7 轉(zhuǎn)氨酶溶液活性的測(cè)定64
• 3.8 基質(zhì)血清血源篩查結(jié)果64-65
• 3.9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇65
• 3.10 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品的瓶?jī)?nèi)均勻性評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)結(jié)果65-66
• 3.11 標(biāo)準(zhǔn)品的瓶間均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果66-68
• 3.12 標(biāo)準(zhǔn)品的凍融穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果68-70
• 3.13 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品的4℃儲(chǔ)存穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果70-72
• 3.14 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品的室溫放置穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果72-74
• 3.15 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果74-76
• 3.16 轉(zhuǎn)氨酶的定值結(jié)果76-77
• 3.17 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定性評(píng)估結(jié)果77-79
• 3.17.1 測(cè)量不確定度（Uchar）對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)77-78
• 3.17.2 瓶間不確定度（Ubb）對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)78-79
• 3.17.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性不確定度（Uchar）對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)79
• 3.17.4 轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)品總不確定度的計(jì)算79
• 3.18 本節(jié)總結(jié)79-80
• 4 本章討論80-88
• 4.1 目的基因的優(yōu)化80-81
• 4.2 表達(dá)載體的選擇81
• 4.3 蛋白誘導(dǎo)條件的探索81-82
• 4.4 目的蛋白的純化82-83
• 4.5 標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)的處理83
• 4.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性評(píng)價(jià)83-84
• 4.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)84-85
• 4.8 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值與不確定性評(píng)估85-86
• 4.9 小結(jié)86-88
• 第二章 人巨細(xì)胞病毒（HCMV）IgG抗體參考品研制88-108
• 1. 概述88-93
• 1.1 巨細(xì)胞病毒的生物學(xué)特性88-89
• 1.2 人巨細(xì)胞病毒感染的傳播途徑89
• 1.3 人巨細(xì)胞病毒對(duì)人類的損害89-90
• 1.4 人巨細(xì)胞病毒感染的防治90
• 1.5 人巨細(xì)胞病毒感染的診斷方法90-93
• 1.6 人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品研制的意義93
• 2 材料和方法93-99
• 2.1 試驗(yàn)儀器與試劑93-94
• 2.1.1 試驗(yàn)儀器93
• 2.1.2 試驗(yàn)試劑93
• 2.1.3 生物材料93-94
• 2.2 試驗(yàn)方法94-99
• 2.2.1 收集血漿的處理94
• 2.2.2 血清的篩選94
• 2.2.3 血清的血源篩查試驗(yàn)94-95
• 2.2.4 篩選血清的復(fù)核95-96
• 2.2.5 篩選血清的確認(rèn)96
• 2.2.6 人巨細(xì)胞病毒IgG參考品盤的制備96-97
• 2.2.7 人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品盤驗(yàn)證97
• 2.2.8 人巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品盤穩(wěn)定性考察97-99
• 3 試驗(yàn)結(jié)果99-105
• 3.1 血清的篩選試驗(yàn)結(jié)果99
• 3.2 血源篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果99-100
• 3.3 血清復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果100-101
• 3.4 篩選血清的確認(rèn)試驗(yàn)101-103
• 3.4.1 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果101-102
• 3.4.2 Westernblot試驗(yàn)結(jié)果102-103
• 3.5 靈敏度參考品的確定試驗(yàn)結(jié)果103
• 3.6 參考品盤的驗(yàn)證結(jié)果103-104
• 3.7 參考品盤的穩(wěn)定性考察結(jié)果104-105
• 4 本章討論105-108
• 4.1 參考品盤原料的選擇105-106
• 4.2 篩選血清的復(fù)核與確認(rèn)106
• 4.3 靈敏度參考品的確定106
• 4.4 參考品盤的穩(wěn)定性考察106-108
• 文章結(jié)論108-109
• 參考文獻(xiàn)109-113
• 文獻(xiàn)綜述113-125
• 參考文獻(xiàn)121-125
• 發(fā)表學(xué)術(shù)論文與申請(qǐng)國(guó)家專利情況125-126
• 致謝126-127

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：562176