本文關鍵詞：天然反義RNA分子TIRAP-AS的功能研究

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【摘要】：非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)是一類在細胞中不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子,通常沒有明顯的開放閱讀框(open reading frame,ORF),非編碼RNA廣泛存在于人類基因組的轉(zhuǎn)錄組中,據(jù)估計約占細胞總轉(zhuǎn)錄本的90%以上。ncRNA可由專一的非編碼RNA基因轉(zhuǎn)錄而來,也可源自蛋白質(zhì)編碼基因的反義鏈、內(nèi)含子以及蛋白質(zhì)編碼基因間的序列。目前,ncRNA尚未有一個明確的分類標準,通常依據(jù)其轉(zhuǎn)錄本的長度人為地將超過200nt的稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),其余的則稱為短鏈非編碼RNA。非編碼RNA曾被認為只是基因組轉(zhuǎn)錄活動的“噪音”,但近年來大量的研究表明,ncRNA在細胞中的表達具有明顯的時空特異性,而對部分ncRNA生物學功能的研究進一步提示其在細胞的生命活動中扮演著極為重要的角色。在細胞中,ncRNA主要是以RNA的形式發(fā)揮其功能,它們通過堿基互補配對與其他核酸分子相互結(jié)合、模擬其他生物大分子的空間結(jié)構(gòu)而競爭性地抑制其與相互作用分子的結(jié)合、通過空間阻遏作用而干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄活動、募集染色質(zhì)修飾相關的蛋白質(zhì)而改變靶基因的表觀遺傳修飾等,從而在多種水平、不同層次上調(diào)節(jié)生命活動的正常進行。天然反義RNA,也稱天然反義轉(zhuǎn)錄本(naturally antisense transcripts, NATs),是指在細胞中由編碼正義RNA(通常為蛋白質(zhì)編碼基因)DNA鏈互補的DNA鏈(即反義DNA)編碼的轉(zhuǎn)錄本。其中絕大部分為非編碼RNA,但也有極少部分在細胞中可翻譯成蛋白質(zhì)。NATs最早在病毒和原核生物中被發(fā)現(xiàn),隨后的研究表明天然反義RNA的表達是真核生物基因組轉(zhuǎn)錄的一種普遍現(xiàn)象,在小鼠與人基因組中70%的轉(zhuǎn)錄單元(transcript unit)存在天然反義RNA,其中有約17%的NATs分子在小鼠與人類中是保守的。雖然高等真核細胞中大多數(shù)基因都存在天然反義RNA,但已被實驗鑒定的僅占其中極小的一部分,我們目前所面臨的最大挑戰(zhàn)是通過實驗來驗證這些天然反義RNA的存在并揭示其生物學功能。NATs根據(jù)其來源的不同可以劃分為順式NATs (cis-NATs,在其轉(zhuǎn)錄位點的局部發(fā)揮生物學功能)和反式NATs (trans-NATs,可以在其轉(zhuǎn)錄位點以外的其他區(qū)域發(fā)揮功能)兩類,其在細胞中通過轉(zhuǎn)錄阻滯、基因組重排、染色質(zhì)重構(gòu)、基因組印記、調(diào)控mRNA選擇性拼接、mRNA的編輯和細胞內(nèi)的定位、調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率、屏蔽靶mRNA分子上的miRNA結(jié)合位點以及形成內(nèi)源性siRNA等來調(diào)控靶基因的表達。已有的研究表明,絕大部分已被鑒定的NATs在細胞中抑制靶基因的表達,但也有少數(shù)可上調(diào)靶基因的表達。通過對已發(fā)表文獻的檢索及GenBank中表達序列標簽(Expressed Sequence Tag,EST)數(shù)據(jù)庫的分析,我們發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)信號通路中重要的接頭蛋白(adaptor protein)TIRAP/Mal (TIR domain-containing adaptor protein/MyD88 adaptor-like)的編碼基因在小鼠與人中存在保守的天然反義RNA (TIRAP-AS)。在小鼠中,TIRAP基因定位于9號染色體,基因組序列全長16kb,由7個外顯子組成。而我們通過生物信息學分析鑒定的TIRAP-AS基因由3個外顯子組成,其中第1外顯子與TIRAP基因的第6外顯子的大部分序列反向互補(圖2),其內(nèi)含子的剪切位置符合GT-AG拼接規(guī)則,且存在典型的polyA加尾信號。此外,來源于TIRAP-AS的EST序列UI-M-BH1-ami-a-04-0-UI.s2(GenBank登記號)含有明確的polyA序列,提示TIRAP-AS是細胞中經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工的成熟RNA分子,并非基因組非特異性轉(zhuǎn)錄活動的產(chǎn)物。TIRAP蛋白在細胞中主要是參與MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑,當特異性激活TLR2或TLR4時,TIRAP首先移位至細胞膜并通過其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, PIP2)結(jié)構(gòu)域與PIP2結(jié)合,然后再通過保守的TIR(Toll/interleukin 1 receptor domain-containing)結(jié)構(gòu)域與MyD88蛋白結(jié)合并將其募集至TLR受體,繼而激活下游的MAPK蛋白激酶與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,誘導促炎細胞因子如TNF-a與IL-1等的表達。可見,TIRAP在MyD88依賴的信號通路的激活中具有不可替代的作用。綜上所述,作為參與TLR受體信號傳導通路的重要分子,TIRAP蛋白在細胞中的功能改變將直接導致機體的先天性免疫反應異常。但目前對TIRAP基因的表達調(diào)控機制還知之甚少,其天然反義RNA分子(TIRAP-AS)是否在細胞內(nèi)調(diào)控TIRAP基因的表達?其具體的調(diào)控機制及其生物學意義是什么?對這些問題的深入研究將有助于揭示TIRAP基因在細胞中的表達調(diào)控機制,促進我們對TIRAP在先天性免疫反應中功能的進一步認識。針對上述科學問題,我們以已知的TIRAP-AS EST序列為基礎,通過cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE) PCR技術從來源于小鼠的單核巨噬細胞RAW264.7中克隆獲得TIRAP-AS的全長cDNA序列。我們克隆的TIRAP-AS基因cDNA存在十種不同形式的拼接體,其長度在1000nt至1200nt之間,與TIRAP mRNA的重疊配對區(qū)(overlapping region)長度為447個核苷酸(nucleotide,nt).生物信息學分析顯示這些TIRAP-AS分子缺乏明顯的開放性閱讀框,極有可能是非編碼RNA分子。此外,TIRAP-AS基因內(nèi)含子的剪切位置完全符合經(jīng)典的GT-AG拼接(splicing)規(guī)則,存在典型的poly A加尾信號,而且我們克隆獲得的TIRAP-AS cDNA序列3’末端含有polyA序列,表明TIRAP-AS在細胞中需要經(jīng)過復雜的轉(zhuǎn)錄后加工。在獲得TIRAP-AS RNA10種選擇性拼接體序列的基礎上,我們設計了可特異性區(qū)分它們的引物,以來源于RAW264.7細胞cDNA為模板,以含有TIRAP-AS選擇性拼接體的質(zhì)粒為陽性對照,進行PCR擴增,結(jié)果顯示選擇性拼接體1A、1B、1D與1E相對表達水平較高,是其在RAW264.7細胞中表達的主要形式。在此基礎上,我們分別以含有TIRAP與TIRAP-AS cDNA的質(zhì)粒為標準參照,采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術分析了TIRAP mRNA與TIRAP-ASRNA分子在RAW264.7細胞中的相對表達水平,結(jié)果表明TIRAP mRNA的表達水平大約是TIRAP-AS RNA的8倍。此外,我們還采用了定量PCR分析了TIRAP mRNA與TIRAP-AS RNA在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、皮膚等8種不同的組織中的相對表達水平,以P-actin為內(nèi)參照,結(jié)果顯示TIRAP mRNA在不同組織中的表達水平由高到低依次為：肝肌肉心臟腎肺脾皮膚腦,而TIRAP-AS RNA分子在不同組織中的表達水平則為：肝肌肉心臟肺腦皮膚腎脾。同時,我們還采用Western蛋白印跡分析了TIRAP蛋白質(zhì)在不同組織中的表達水平,若以心臟為對照組,則它在腦組織中的表達相對較高,在脾、肺、肌肉等組織中的表達相當,在肝和皮膚組織中的表達相對較低,在腎組織中幾乎不表達。由于TIRAP蛋白主要參與TLR2與TLR4激活后的下游信號轉(zhuǎn)導,我們首先采用100ng/ml LPS (TLR4特異性激動劑)和100ng/ml Pam2CSK4(TLR2特異性激動劑)刺激RAW264.7細胞和,于不同時間點(Omin、30min、60min、 120min、240min、480min)收集細胞,采用實時熒光定量PCR技術檢測TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表達水平的變化,同時采用Western蛋白印跡技術檢測TIRAP蛋白表達水平。結(jié)果顯示：激活TLR2或TLR4受體可誘導RAW264.7細胞TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平均呈現(xiàn)出類似的時間依賴性改變；而且LPS刺激可誘導RAW264.7細胞中TIRAP蛋白呈現(xiàn)時間依賴性的下降。此外,采用100ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophage,BMM)誘導TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表達水平的變化趨勢與RAW264.7基本一致。為了進一步分析其他類型的TLR受體激活對TIRAP mRNA與TIRAP-ASRNA表達水平的影響,我們分別采用小鼠TLR1-9不同激動劑刺激RAW264.7細胞1h,回收細胞并采用實時熒光定量PCR分析TIRAP mRNA和TIRAP-ASRNA的表達水平的變化,結(jié)果顯示100 ng/ml Pam3CSK4(TLR1/2特異性激動劑)與5μM ODN1826(TLR9特異性激動劑)同樣可以誘導RAW264.7細胞中TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平的顯著性下降(p0.05)。以上結(jié)果提示TIRAP mRNA與TIRAP-AS RNA水平的動態(tài)變化可能參與了對細胞炎癥反應的調(diào)控。在以上結(jié)果的基礎上,我們分別采用200nM wortmannin(PI3K/Akt抑制劑)、200nM SP600125 (JNK1/2抑制劑)、200nM PD98059 (ERK1/2抑制劑)與10μM SB203580(p38抑制劑)等特異性的蛋白激酶抑制劑預處理RAW264.7細胞1h,然后再采用LPS刺激1h,定量PCR分析結(jié)果表明200nM wortmannin預處理可特異性地抑制LPS誘導的TIRAP-AS RNA水平的下降(p0.05),但對TIRAP mRNA的表達水平無明顯影響,而MAPK蛋白激酶抑制劑則對兩者的表達水平均無明顯的影響,表明LPS刺激是通過激活PI3K7Akt蛋白激酶誘導了TIRAP-ASRNA的下調(diào)。最后,為了探索LPS誘導的TIRAP-AS RNA表達水平下調(diào)的分子機制,我們首先采用100ng/ml LPS預處理RAW264.7細胞1h,然后再加入5μg/ml的放線菌素D(actinomycin D,ActD)抑制RNA的轉(zhuǎn)錄,于不同時間點(Omin、30min、 60min、90min、120min)回收細胞并采用定量PCR分析TIRAP mRNA與TIRAP-AS RNA表達水平的變化。結(jié)果顯示LPS刺激可以降低RAW264.7細胞中TIRAP-AS RNA的穩(wěn)定性,但對TIRAP mRNA的穩(wěn)定性未有明顯影響。而采用200nM wortwannin預處理1h則可以完全抑制LPS刺激誘導的TIRAP-AS RNA穩(wěn)定性的下降,表明LPS刺激可通過激活PI3K/Akt激酶而誘導TIRAP-AS RNA穩(wěn)定性的下降,從而導致其在細胞內(nèi)的表達水平的下調(diào)。綜上所述,本論文已取得的實驗結(jié)果如下：1.通過RACE PCR技術成功克隆了在RAW264.7細胞中表達的十種TIRAP-AS選擇性拼接體cDNA全長序列,其中拼接體TIRAP-AS 1A、1B、1D與1E是其最主要的表達形式;2.RAW264.7細胞中TIRAP mRNA表達水平約是TIRAP-AS RNA的8倍；3.TIRAP mRNA在C57BL/6小鼠不同組織中的表達水平由高到低依次為：肝肌肉心臟腎肺脾皮膚腦,而TIRAP-AS RNA分子在不同組織中的表達水平則為：肝肌肉心臟肺腦皮膚腎脾。若以心臟為對照組,則TIRAP蛋白質(zhì)水平在腦組織中的表達相對較高,在脾、肺、肌肉等組織中的表達相當,在肝和皮膚組織中的表達相對較低,在腎組織中幾乎不表達；4.特異性激活TLR2與TLR4均可誘導TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表達水平呈現(xiàn)出類似的時間依賴性改變,TIRAP蛋白呈現(xiàn)時間依賴性的下降；5.LPS激活TLR4誘導TIRAP-AS RNA分子穩(wěn)定性的下降,并下調(diào)其在細胞中的表達水平,可能是通過激活PI3K/Akt蛋白激酶誘導的�？傊�,我們通過研究鑒定了TIRAP基因的天然反義RNA分子,特異性的炎癥刺激可通過激活TLR2與TLR4受體信號通路,激活其下游的PI3K/Akt蛋白激酶并誘導TIRAP-AS RNA穩(wěn)定性的下降,從而導致其在細胞中表達水平的下調(diào),但其具體的分子機制尚有待進一步的實驗去揭示。
【關鍵詞】：TIRAP 反義TIRAP Toll樣受體 非編碼RNA 天然反義轉(zhuǎn)錄物 脂多糖
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-22
• 總體技術路線圖22-23
• 材料23-28
• 方法28-42
• 結(jié)果42-59
• 討論59-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻66-71
• 在讀碩士期間發(fā)表文章71-72
• 中英文縮略詞表72-74
• 致謝74-75

【共引文獻】

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本文編號：550290