本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對(duì)腎小球足細(xì)胞mTOR的作用研究

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【摘要】：一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：通過(guò)Ficoll密度梯度離心和貼壁分離法體外分離、培養(yǎng)適合實(shí)驗(yàn)研究的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 方法： 1，無(wú)菌條件下取出健康雄性SD大鼠股、脛骨,采用Ficoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離純化BMSCs，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。傳至P3代時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)并鑒定。 2.用成脂、成骨誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)BMSCs向成脂和成骨分化，用油紅O染色檢測(cè)成脂細(xì)胞，用VonKossa染色法染色檢測(cè)成骨細(xì)胞。 3.用流式細(xì)胞鑒定BMSCs表面的抗原標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90。結(jié)果:鏡下觀察BMSCs呈梭形、多角形成纖維細(xì)胞樣形態(tài),大小一致。BMSCs加入成骨和成脂誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)出成骨和成脂細(xì)胞。BMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)其抗原標(biāo)志物提示CD29、CD90強(qiáng)陽(yáng)性，低表達(dá)CD45、CD34，細(xì)胞純度高。 結(jié)論：采用Ficoll密度梯度離心和體外細(xì)胞貼壁分離培養(yǎng)法相結(jié)合提取的BMSCs，穩(wěn)定性好，活性高，可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 第二部分足細(xì)胞原代的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：通過(guò)過(guò)篩法分離腎小球，胰酶消化破膜后，并進(jìn)行足細(xì)胞原代培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的足細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，供實(shí)驗(yàn)使用。 方法：1.無(wú)菌條件下取出雄性SD大鼠兩側(cè)腎臟，剪碎腎皮質(zhì)后，用80目，150目，200目網(wǎng)篩分離腎小球，并用光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球形態(tài)。 2.收集并用Ⅳ型膠原酶消化腎小球，種植在用Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，5d后在在顯微鏡下觀察腎小球形態(tài)。 3.測(cè)定細(xì)胞表面的上neprin和WT-1抗原。 結(jié)果：用過(guò)篩法可分離出高純度的腎小球，并用Ⅳ型膠原酶消化后種植在培養(yǎng)瓶中3天后從腎小球中爬出成鵝卵石樣細(xì)胞，，所提取的細(xì)胞經(jīng)足細(xì)胞特異性表位WT-1和nephrin鑒定為足細(xì)胞。 結(jié)論：用過(guò)篩法結(jié)合Ⅳ型膠原酶消化法能培養(yǎng)出細(xì)胞，經(jīng)鑒定培養(yǎng)出的細(xì)胞為符合實(shí)驗(yàn)要求足細(xì)胞。 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對(duì)腎小球足細(xì)胞mTOR的作用研究。 目的：探討B(tài)MSCs對(duì)保護(hù)嘌呤霉素?fù)p傷足細(xì)胞的作用研究及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在此過(guò)程中的表達(dá)； 方法： 實(shí)驗(yàn)分組： 正常組：足細(xì)胞； 嘌呤霉素組：足細(xì)胞+嘌呤霉素(5ug/ml)； 干細(xì)胞組：足細(xì)胞+BMSCs（共培養(yǎng)24h）+嘌呤霉素(5ug/ml)； 各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)3h后通過(guò)普通RT-PCR檢測(cè)nephrin mRNA和用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)nephrin、mTOR、p-mTOR蛋白的的表達(dá)。 結(jié)果： 1、普通人體RT-PCR電泳示：正常組、嘌呤霉素組、干細(xì)胞組nephrin mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異。 2. Western bolt結(jié)果示：正常組、嘌呤霉素組、干細(xì)胞組nephrin蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異；嘌呤霉素組相比正常對(duì)照組p-mTOR蛋白的表達(dá)上調(diào)；干細(xì)胞組與嘌呤霉素組相比p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低。 結(jié)論：BMSCs保護(hù)嘌呤霉素?fù)p傷的足細(xì)胞作用可能與mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Ficoll密度梯度離心法 VonKossa染色法 足細(xì)胞 nephrin蛋白 過(guò)篩法 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 足細(xì)胞 嘌呤霉素 哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 目錄3-4
• 英文縮略4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分： 大鼠 BMSCs 的提取、培養(yǎng)及鑒定14-25
• 引言14
• 材料與設(shè)備14-15
• 方法15-20
• 結(jié)果20-23
• 討論23-24
• 小結(jié)24-25
• 第二部分： 大鼠腎臟足細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定25-32
• 引言25
• 材料與設(shè)備25-26
• 方法26-28
• 結(jié)果28-30
• 討論30-31
• 小結(jié)31-32
• 第三部分： 大鼠 BMSCs 對(duì)腎小球足細(xì)胞 mTOR 的作用研究32-42
• 引言32
• 材料與設(shè)備32-35
• 方法35-39
• 結(jié)果39-41
• 討論41-42
• 小結(jié)42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 致謝47-48
• 綜述48-55
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 在校期間發(fā)表論文情況55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：536671