發(fā)布時間：2017-07-07 03:15

  本文關(guān)鍵詞：HGF促進hUCMSCs血管新生的體外研究

  更多相關(guān)文章： 肝細胞生長因子 人臍帶間充質(zhì)干細胞 血管新生 Notch1 腺病毒 EphB4 ephrin B2

【摘要】：目的：缺血性疾病，如缺血性腦卒中、缺血性心肌病、股骨頭缺血性壞死、缺血性腸病等，是臨床上一類嚴重危害人民群眾健康的疾病。隨著近年來社會和經(jīng)濟的不斷發(fā)展人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，高糖高脂飲食，生活工作壓力增加，社會人口老年化等原因，導致該類疾病的發(fā)病率逐年上升并且趨向年輕化，已成為困擾公眾的社會問題。由于該類疾病致病過程慢性進行性、發(fā)病突然、致死致殘率高，不但嚴重影響了患者生活質(zhì)量，使其飽受痛苦，還給其家庭、社會及國家?guī)砹顺林刎摀?目前臨床上通過采用藥物溶栓或抗凝、血管搭橋、介入手術(shù)等方式治療，在一定程度上可以改善患者的癥狀，但如果血管呈彌漫性病變或病變發(fā)生在直徑小于2mm的小血管，則無法取得滿意療效，而且手術(shù)存在再灌注損傷、危險性大、并發(fā)癥多、費用昂貴、術(shù)后再狹窄等缺點。因此，探索一個有效、簡便、可行的治療方法是當前迫切需要解決的問題。 1993年，由Hockel等最早提出的應(yīng)用治療性血管新生療法，通過刺激局部血管的再生和損傷組織的再建達到治療目的，是目前缺血性疾病治療、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域備受矚目的研究重點[1]。前期我們發(fā)現(xiàn)HGF有促進燒傷創(chuàng)面愈合，修復(fù)創(chuàng)傷部位[2]；對犬下肢靜脈缺血模型的血管及肌肉等組織具有保護作用[3,4]；同時可以上調(diào)Notch1及Dll4的mRNA水平[5]�；诖�，本研究以hUCMSCs為體外研究細胞模型，以前期課題組合成的重組腺病毒Ad-HGF為研究對象，系統(tǒng)分析Ad-HGF通過Notch1/Dll4信號通路的調(diào)控作用對hUCMSCs增殖能力、細胞周期、細胞毛細管腔狀結(jié)構(gòu)形成、遷移能力等功能的影響；Notch1/Dll4信號通路及血管動靜脈標志物轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平的變化。最終闡明HGF與hUCMSCs信號通路的關(guān)系及機制，揭示Ad-HGF促進動靜脈血管分化的作用，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。 一、人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及誘導分化。 方法：取正常足月生產(chǎn)新生兒臍帶，采取組織貼壁法分離原代hUCMSCs，觀察細胞生長形態(tài)。采取流式細胞儀技術(shù)檢測hUCMSCs細胞表型及細胞周期。通過成神經(jīng)細胞誘導和成脂肪細胞誘導鑒定hUCMSCs的誘導分化能力。 結(jié)果：成功分離和培養(yǎng)hUCMSCs原代細胞。細胞經(jīng)流式細胞儀鑒定高表達間質(zhì)細胞標志CD44（96.73%）和CD105（96.10%），整合素受體CD29（99.53%）；低表達造血系標志CD34（0.8%）和CD45（1.91%），人白細胞抗原HLA-DR（1.41%），符合hUCMSCs細胞表型特征。細胞周期檢測大部分hUCMSCs處于G0/G1期。hUCMSCs成神經(jīng)細胞誘導，出現(xiàn)神經(jīng)元樣細胞，Nestin蛋白免疫組化檢測陽性。hUCMSCs成脂肪細胞誘導，出現(xiàn)空泡樣脂滴，油紅O染色檢測陽性。 結(jié)論：成功分離及培養(yǎng)了具有多向分化潛能的hUCMSCs，可以用于后續(xù)實驗的研究。 二、人Notch1受體shRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定。 方法：根據(jù)Gene Bank中Notch1基因mRNA序列(NM_017617)設(shè)計合成shRNA序列，并且連接到pGenesil-1.1質(zhì)粒上，酶切及測序鑒定。通過體外同源重組將Notch1-shRNA表達框轉(zhuǎn)移至腺病毒表達載體pGsadeno上，酶切線性化后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細胞HEK293，制備獲得重組腺病毒。腺病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs，觀察細胞形態(tài)及GFP蛋白的表達，，提取總RNA和總蛋白，RT-PCR及Western Blot檢測細胞Notch1的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平。 結(jié)果：經(jīng)酶切及DNA測序重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)染hUCMSCs后，RT-PCR及Western Blot檢測，可顯著抑制細胞Notch1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，對基因轉(zhuǎn)錄沉默效率約為68.04%（P＜0.05）；對蛋白表達默效率約為80.32%（P＜0.05）。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組腺病毒rAd5-Notch1-shRNA，能高效轉(zhuǎn)染hUCMSCs細胞，具有Notch1基因沉默效應(yīng)。 三、Ad-HGF誘導hUCMSCs向血管動靜脈內(nèi)皮細胞分化的體外研究。 方法：以hUCMSCs為研究對象，實驗分為五組：腺病毒Ad-GFP組、Ad-GFP-Notch1-shRNA組（簡稱為Ad-shRNA組）、Ad-GFP-NICD組（簡稱為Ad-NICD組）、Ad-HGF組和空白對照組。首先通過MTT實驗檢測各組細胞生存率，判定各組腺病毒的最佳感染MOI。顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)。ELISA實驗檢測Ad-HGF組細胞培養(yǎng)上清中HGF的表達水平。MTT法測定OD490nm值，繪制細胞生長曲線。流式細胞儀檢測各組細胞周期情況。隨后分別檢測各組細胞貼壁能力、遷移能力及體外成血管能力。實時定量熒光PCR法檢測Notch信號通路中：Notch1、Dll4及Hey-2基因；靜脈標志物EphB4基因；動脈標志物ephrin B2基因的轉(zhuǎn)錄水平。最后WesternBolt檢測Notch1、EphB4及ephrin B2蛋白的表達。 結(jié)果：Ad-GFP組最佳MOI為100倍；Ad-NICD組、Ad-shRNA組及Ad-HGF組最佳MOI為50倍。轉(zhuǎn)染后鏡下觀察，除Ad-HGF組外，其他各組，均出現(xiàn)GFP的表達；Ad-NICD組，細胞增殖速度快，形成多個不完整的管腔樣結(jié)構(gòu)；Ad-HGF組，細胞分散生長，早期增殖速度較快，隨后出現(xiàn)了大量的分泌小泡。ELISA檢測Ad-HGF組培養(yǎng)48h后，上清中HGF的表達與對照組相比顯著增多（P＜0.05），96h達到峰值562.97±27.09pg/mL。Ad-NICD組和Ad-HGF組能顯著促進細胞增殖，在48、72、96h時具有顯著差異（P＜0.05）；Ad-shRNA組能抑制細胞增殖，在72h時具有顯著差異（P＜0.05）。流式細胞儀檢測，Ad-NICD組細胞S期比例有較大增高（36.02%），細胞DNA復(fù)制活躍，具有較強增殖活性。細胞貼壁實驗中，Ad-HGF組在12、16、20h及Ad-NICD組在20h細胞貼壁率大于對照組（P＜0.05）；Ad-shRNA組在8、12、16h細胞貼壁率小于對照組（P＜0.05）。Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)Ad-HGF組及Ad-NICD組能促進細胞遷移，而Ad-shRNA組抑制細胞遷移（P＜0.05）。體外成血管實驗，Ad-NICD組和Ad-HGF組出現(xiàn)了明顯的管狀結(jié)構(gòu)，其余各組未見。實時定量熒光PCR檢測，Ad-HGF組及Ad-NICD組的Notch1、Dll4、Hey-2基因轉(zhuǎn)錄水平高于其余各組（P＜0.05），而Ad-shRNA組則低于其余各組（P＜0.05），Ad-GFP組與空白對照組之間、Ad-HGF組與Ad-NICD組之間無統(tǒng)計學差異（P0.05）。靜脈標志物EphB4基因，Ad-GFP組、Ad-HGF組及Ad-shRNA組與空白對照組相比較，無統(tǒng)計學差異（P0.05），而Ad-NICD組基因轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組（P0.05）。動脈標志物ephrin B2基因，Ad-GFP組、Ad-shRNA組和空白對照組之間、Ad-HGF組與Ad-NICD組之間，無統(tǒng)計學差異（P0.05），Ad-HGF組和Ad-NICD組細胞的ephrin B2基因轉(zhuǎn)錄水平高于其余各組（P0.05）。Western Blot檢測，Ad-HGF組與Ad-NICD組高表達Notch1蛋白和ephrin B2蛋白，Ad-shRNA組低表達Notch1蛋白和ephrin B2蛋白，具有統(tǒng)計學差異（P0.05）。 結(jié)論：HGF能通過激活Notch1/Dll4信號通路誘導hUCMSCs向動脈血管分化。
【關(guān)鍵詞】：肝細胞生長因子 人臍帶間充質(zhì)干細胞 血管新生 Notch1 腺病毒 EphB4 ephrin B2
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-20
• 文獻回顧20-28
• 第一部分 人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及誘導分化28-40
• 1 材料28-30
• 1.1 主要儀器設(shè)備28
• 1.2 主要試劑和材料28-30
• 2 方法30-33
• 2.1 hUCMSCs 的原代培養(yǎng)30-31
• 2.2 hUCMSCs 流式細胞儀檢測31
• 2.3 hUCMSCs 成神經(jīng)細胞誘導實驗31-32
• 2.4 hUCMSCs 成脂肪細胞誘導實驗32-33
• 3 結(jié)果33-37
• 3.1 hUCMSCs 原代培養(yǎng)及細胞形態(tài)學觀察33-34
• 3.2 hUCMSCs 細胞流式細胞儀檢測34-35
• 3.3 hUCMSCs 細胞成神經(jīng)細胞誘導35-36
• 3.4 hUCMSCs 細胞成脂肪細胞誘導36-37
• 4 討論37-40
• 第二部分 人 NOTCH1受體SHRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定40-61
• 1 材料40-43
• 1.1 主要儀器設(shè)備40
• 1.2 質(zhì)粒、菌株及細胞株40-41
• 1.3 其他材料41-43
• 2 方法43-53
• 2.1 shRNA 的設(shè)計及合成43-44
• 2.2 重組質(zhì)粒 pGenesil-1.1-Notch1-shRNA 的構(gòu)建及鑒定44-46
• 2.3 重組腺病毒表達質(zhì)粒 pGsadeno- Notch1-shRNA 的構(gòu)建及鑒定46-47
• 2.4 重組腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 的制備47-48
• 2.5 重組腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 的滴度測定48-49
• 2.6 重組腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 沉默效應(yīng)鑒定49-53
• 3 結(jié)果53-57
• 3.1 重組質(zhì)粒 pGenesil-1.1-Notch1-shRNA 的構(gòu)建及鑒定53-55
• 3.2 重組腺病毒質(zhì)粒 pGsadeno-Notch1-shRNA 的構(gòu)建及鑒定55
• 3.3 重組腺病毒 rAd5-Notch1-shRNA 的制備55
• 3.4 腺病毒轉(zhuǎn)染 hUCMSCs 細胞形態(tài)及 GFP 表達情況的觀察55-56
• 3.5 腺病毒轉(zhuǎn)染 hUCMSCs 后，對 Notch1 轉(zhuǎn)錄水平的沉默效應(yīng)56
• 3.6 腺病毒轉(zhuǎn)染 hUCMSCs 后，對 Notch1 蛋白表達水平的沉默效應(yīng)56-57
• 4 討論57-61
• 第三部分 AD-HGF誘導HUCMSCS向血管動靜脈內(nèi)皮細胞分化的體外研究61-82
• 1 材料61-63
• 1.1 主要儀器設(shè)備61
• 1.2 腺病毒及細胞株61-62
• 1.3 引物合成、工具酶等62
• 1.4 主其他要試劑及材料62
• 1.5 常用試劑的配置方法62-63
• 2 方法63-66
• 2.1 腺病毒感染 hUCMSCs 最佳 MOI 的測定63
• 2.2 腺病毒感染 hUCMSCs 細胞形態(tài)學觀察63
• 2.3 ELISA 檢測腺病毒 Ad-HGF 感染 hUCMSCs 后 HGF 水平63-64
• 2.4 MTT 檢測腺病毒感染 hUCMSCs 生長的影響64
• 2.5 流式細胞儀檢測腺病毒感染 hUCMSCs 細胞生長周期的影響64
• 2.6 細胞貼壁實驗檢測腺病毒感染 hUCMSCs 貼壁能力的影響64
• 2.7 Transwell 小室檢測腺病毒感染 hUCMSCs 遷移能力的影響64-65
• 2.8 體外成血管實驗檢測腺病毒感染 hUCMSCs 血管生成能力的影響65
• 2.9 實時定量熒光 PCR 檢測血管分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平65-66
• 2.10 Western Blot 檢測血管分化相關(guān)蛋白的表達水平66
• 2.11 統(tǒng)計學分析66
• 3 結(jié)果66-76
• 3.1 腺病毒感染 hUCMSCs 最佳 MOI 的測定66-67
• 3.2 腺病毒感染 hUCMSCs 細胞形態(tài)學觀察67-68
• 3.3 ELISA 檢測腺病毒 Ad-HGF 感染 hUCMSCs 后 HGF 水平68-69
• 3.4 MTT 檢測腺病毒感染 hUCMSCs 生長的影響69-70
• 3.5 流式細胞儀檢測腺病毒感染 hUCMSCs 細胞生長周期的影響70
• 3.6 細胞貼壁實驗檢測腺病毒感染 hUCMSCs 貼壁能力的影響70-71
• 3.7 Transwell 小室檢測腺病毒感染 hUCMSCs 遷移能力的影響71-73
• 3.8 體外成血管實驗檢測腺病毒感染 hUCMSCs 血管生成能力的影響73
• 3.9 實時定量熒光 PCR 檢測血管分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平73-75
• 3.10 Western Blot 檢測血管分化相關(guān)蛋白的表達水平75-76
• 4 討論76-82
• 小結(jié)82-83
• 參考文獻83-95
• 個人簡歷和研究成果95-97
• 致謝97

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 高玉芳;哈小琴;付曉霞;呂同德;唐瑜;賈慶華;;HGF對人股動脈內(nèi)皮細胞中Notch1和Dll4基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用[J];第四軍醫(yī)大學學報;2009年20期

2 哈小琴,苑賓,李元敏,勞妙芬,吳祖澤;Gene therapy for pathological scar with hepatocyte growth factor mediated by recombinant adenovirus vector[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2003年03期

3 程欣;皮婷;肖飛;馬劉紅;徐建兵;羅煥敏;;人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導分化為神經(jīng)元樣細胞[J];基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床;2011年03期

4 馬錫慧;馮凱;石炳毅;;人臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性及其研究進展[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

5 黃韻,哈小琴,吳祖澤;腺病毒介導人肝細胞生長因子對大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用[J];中國應(yīng)用生理學雜志;2004年02期

6 哈小琴;任建平;呂同德;張慶林;畢建進;吳祖澤;;局部pUDKH基因治療對實驗性犬缺血肢體的某些生理、生化變化的影響[J];中國應(yīng)用生理學雜志;2007年02期

7 哈小琴,李元敏,勞妙芬,苑賓,吳祖澤;Effect of human hepatocyte growth factor on promoting wound healing and preventing scar formation by adenovirus-mediated gene transfer[J];Chinese Medical Journal;2003年07期

本文編號：528710