發(fā)布時間：2017-07-06 05:07

  本文關(guān)鍵詞：約氏瘧原蟲紅外期感染小鼠模型的建立及感染肝細胞miRNA表達譜分析

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【摘要】：瘧疾仍然是嚴重危害人類身體健康和生命安全的寄生蟲疾病。瘧原蟲抗藥性和蚊媒對殺蟲劑抗性的出現(xiàn)和擴散使瘧疾流行形勢進一步惡化。目前瘧疾防治迫切需要新的技術(shù)、方法和策略。防治技術(shù)突破的重要基礎(chǔ)是需要對病原體生物學(xué)的深刻理解以及病原體與宿主相互作用的功能分子發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。瘧原蟲生活史復(fù)雜，包括了蚊體內(nèi)發(fā)育階段（蚊期）和脊椎動物體內(nèi)發(fā)育階段，其中在脊椎動物體內(nèi)又可分為肝細胞內(nèi)發(fā)育階段（紅外期或肝期）和紅細胞內(nèi)發(fā)育階段（紅內(nèi)期）。瘧原蟲子孢子經(jīng)按蚊叮咬進入脊椎動物體內(nèi)，首先侵入肝實質(zhì)細胞并在其中進行裂體增殖，產(chǎn)生的裂殖子釋放入血并感染紅細胞。雖然紅內(nèi)期是瘧原蟲主要致病階段，，而肝期（紅外期）發(fā)育不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但是肝期是瘧原蟲在脊椎動物中建立感染的首要階段。因此，阻斷瘧原蟲對肝細胞的入侵或在其中的生長發(fā)育，就可以有效阻斷感染，是新型防治技術(shù)研發(fā)的重要靶點。由于瘧原蟲紅外期研究材料獲得的限制，以往瘧疾研究大多以紅內(nèi)期原蟲為研究對象。近年來，多種新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用使得我們能夠?qū)Ο懺x肝期發(fā)育階段開展更為深入的研究。 瘧原蟲與宿主相互作用及其細胞和分子機制研究，一直是瘧原蟲生物學(xué)研究領(lǐng)域的重點、熱點，也是發(fā)展新的藥物、疫苗和瘧疾防治策略的基礎(chǔ)。同樣，在肝期瘧原蟲與宿主相互作用中的關(guān)鍵性因子及其對肝期瘧原蟲生長發(fā)育的作用也是研究的熱點。目前，相關(guān)研究進展主要集中在發(fā)現(xiàn)一些蟲源性或宿主來源的分子及其對肝期瘧原蟲發(fā)育繁殖的作用。而現(xiàn)今生命科學(xué)研究熱點之一的miRNA對瘧原蟲生長發(fā)育的影響只有少量研究報道。 miRNA是一類非編碼小RNA分子，長度為18-22個核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因功能，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生等過程的調(diào)控。新進的報道表明，頂復(fù)門原蟲可以干預(yù)宿主細胞miRNA表達，通過RNAi沉默分子通路，改變宿主細胞內(nèi)的環(huán)境，滿足其生長發(fā)育的需要或抵抗來自宿主的免疫攻擊。瘧原蟲自身不表達miRNA，有報道顯示宿主來源的miRNA對紅內(nèi)期瘧原蟲感染和致病有影響，但宿主肝細胞miRNA對肝期瘧原蟲的作用尚未有報道。對此，為研究宿主肝臟細胞miRNA對肝期瘧原蟲生長發(fā)育繁殖的影響，本課題首先采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達表達綠色熒光蛋白（GFP）的轉(zhuǎn)基因瘧原蟲；利用該轉(zhuǎn)基因蟲株，建立了瘧原蟲整個生活史的實驗?zāi)Ｐ�。通過子孢子的感染，采用流式分選高純度陽性肝實質(zhì)細胞，并以此為材料采用低密度芯片檢測并分析了感染肝細胞miRNA表達譜的變化，具體方法和結(jié)果如下： 1.為了采用流式技術(shù)快速分選感染瘧原蟲的宿主肝細胞，我們構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達GFP的約氏瘧原蟲（PyGFP）。采用AMAXANucleofactor技術(shù)，將線性化的同源重組質(zhì)粒pL0016轉(zhuǎn)染約氏瘧原蟲BY265株。該質(zhì)粒包含有g(shù)fp基因、驅(qū)動GFP表達的持家基因伯氏瘧原蟲翻譯延長因子1α（pbef1αa）的啟動子、用于藥物篩選的乙胺嘧啶抗性基因以及伯氏瘧原蟲ssu-rrna基因。由于伯氏瘧原蟲與約氏瘧原蟲的ssu-rrna具有96%同源性，因此質(zhì)粒與瘧原蟲基因組可發(fā)生同源整合。轉(zhuǎn)染后，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)得到了正確整合的轉(zhuǎn)基因PyGFP蟲株和野生蟲株的混合群體。采用有限稀釋法進行蟲株克隆，獲得了1個轉(zhuǎn)基因PyGFP的單克隆品系。熒光顯微鏡檢查顯示，該單克隆品系原蟲發(fā)出綠色熒光。通過特異性引物PCR鑒定確認該克隆原蟲基因組中發(fā)生了正確整合，且無野生蟲株的污染。 2.建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP整個生活史的實驗?zāi)Ｐ�。PyGFP接種昆明鼠3天后，斯氏按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。感染后第7天和第16天，解剖蚊胃和唾液腺，觀察到發(fā)出綠色熒光的胃壁卵囊和唾液腺。再以陽性按蚊叮咬昆明鼠，7天后觀察到發(fā)出綠色熒光的紅內(nèi)期瘧原蟲。由此表明已成功建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP整個生活史的實驗?zāi)Ｐ�，且各期原蟲均表達GFP。在此基礎(chǔ)上，我們從兩方面對該模型進行了優(yōu)化：（1）優(yōu)化PyGFP對斯氏按蚊的感染。以不同劑量PyGFP原蟲腹腔注射昆明鼠，3天后按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。按蚊感染后第7天,用熒光顯微鏡計數(shù)胃壁卵囊數(shù)。結(jié)果顯示，1×107，5×106和1×106三個劑量組卵囊數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異，各組50%以上按蚊卵囊數(shù)在100-500之間，平均89個；但5×105劑量組，卵囊數(shù)平均20個，與以上三組均有統(tǒng)計學(xué)差異。小鼠初始轉(zhuǎn)種量以每鼠1×106-1×107個紅內(nèi)期PyGFP原蟲為最佳。（2）優(yōu)化PyGFP子孢子對小鼠肝細胞的感染。為獲得高感染效力的子孢子，我們比較了在按蚊感染后不同時間點的子孢子對肝細胞的感染率。將分離的子孢子通過尾靜脈注入BALB/c小鼠，40h后制備肝臟單細胞懸液，經(jīng)流式檢測，計算肝細胞感染率。結(jié)果顯示按蚊感染后第23天分離的子孢子感染效力最強，其宿主肝細胞感染率可達0.083%。 3.感染PyGFP肝細胞分選：采用上述優(yōu)化的蚊期和紅外期感染模型，在斯氏按蚊感染后第23天以不連續(xù)密度梯度法離心分離唾液腺子孢子，計數(shù)子孢子數(shù)。300-800萬個子孢子經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠,即為實驗組；正常斯氏按蚊經(jīng)同樣實驗處理后，將獲得的無子孢子緩沖液尾靜脈注射BALB/c小鼠，即為對照組。40h后，用一步膠原酶灌注消化法制備小鼠肝臟單細胞懸液；流式細胞儀分選肝細胞，先在前向角散射（FSC）和側(cè)向角散射（SSC）散點圖中圈定肝實質(zhì)細胞群；再以對照組細胞在前向角散射（FSC）和熒光FITC散點圖中的分布，劃定正常肝細胞熒光閾值范圍；實驗組中超出閾值的則為陽性感染細胞。經(jīng)流式分選每只感染小鼠可獲得4000-17000個陽性肝細胞。同時分選對照組肝細胞為對照組 4.感染瘧原蟲肝細胞miRNA表達譜的分析：由于獲得感染肝細胞數(shù)量少，得到的總RNA量較低，難以滿足常用的MicroRNA芯片、RNA-Seq等方法對總RNA量的需求，因此我們選擇了敏感性和特異性都較高且對RNA總量需求較少的TaqMANMicroRNA Array低密度芯片，檢測miRNA表達譜變化。以感染后40h的BALB/c小鼠肝臟為實驗組，檢測2個樣本；以正常斯氏按蚊經(jīng)同樣實驗處理后，將獲得的無子孢子緩沖液尾靜脈注射BALB/c小鼠，其肝細胞為對照組，檢測1個樣本。芯片檢測獲得各組各個miRNA的Ct值，以小鼠snoRNA202為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與對照組存在顯著性差異。與正常肝細胞相比，感染肝細胞中有29條miRNA差異表達在3倍以上。其中miR-101a、miR-152、miR-21、miR-122、miR-222、miR-92a、miR-29c、miR-142-3p等17條miRNA表達升高在5倍以上。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，這些miRNA在實驗組與對照組之間有顯著性差異。為驗證這些改變的miRNA，我們采用SYBR Green Real Time PCR法對其中10條miRNA（miR-152、miR-101a、miR-142-3p、miR-122、miR-222、miR-125a-5p、miR-21、miR-29c、miR-19a、let-7c）進行驗證。結(jié)果顯示：驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果比較，這10條miRNA表達變化趨勢基本一致，但倍數(shù)變化不完全相同。為探討差異表達miRNA在瘧原蟲紅前期的作用，我們對差異表達10倍以上的8條miRNA進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶基因顯著分布于TGF-β信號通路，且涉及多種TGF-β相關(guān)分子功能。以往研究發(fā)現(xiàn)：TGF-β通過SMAD信號通路上調(diào)miR-21表達，抑制細胞凋亡。同時瘧原蟲有抑制寄生細胞凋亡的生命現(xiàn)象。因此，我們欲從此方向出發(fā)開展下一步實驗研究。 小結(jié)： 本研究構(gòu)建了生活史各階段穩(wěn)定表達GFP的轉(zhuǎn)基因PyGFP蟲株，建立了該蟲株感染小鼠→按蚊→小鼠完整的生活史動物模型，通過優(yōu)化蚊期和紅外期感染方法，明顯提高了按蚊和宿主肝細胞的感染效率。采用流式技術(shù)實現(xiàn)了快速分選感染瘧原蟲的宿主肝細胞。在此基礎(chǔ)上，利用芯片技術(shù)檢測了感染瘧原蟲的宿主肝細胞miRNA表達譜變化，發(fā)現(xiàn)了17條上調(diào)5倍以上的miRNA，并通過了Real time PCR的驗證。本研究建立了轉(zhuǎn)基因PyGFP完整生活史的實驗?zāi)Ｐ鸵约按_定了感染瘧原蟲肝細胞miRNA表達譜，這些為進一步研究宿主miRNA對肝期瘧原蟲發(fā)育繁殖的功能奠定了堅實基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：約氏瘧原蟲 紅外期 綠色熒光蛋白 microRNA
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R382.31
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-18
• 一、瘧疾的危害13
• 二、紅外期瘧原蟲與宿主相互作用的研究進展13-15
• 三、宿主 miRNA 介導(dǎo)瘧原蟲與宿主相互作用的研究進展15-17
• 四、本課題研究內(nèi)容及意義17-18
• 材料與方法18-30
• 一、材料18-20
• 二、方法與步驟20-30
• 結(jié)果30-43
• 一、轉(zhuǎn)基因 PyGFP 蟲株的構(gòu)建和鑒定30-33
• 二、PyGFP 蚊期和小鼠紅外期感染模型的建立及優(yōu)化33-38
• 三、感染 PyGFP 肝細胞 miRNA 表達譜的檢測、驗證及生物信息學(xué)分析38-43
• 討論43-47
• 結(jié)論與意義47-48
• 參考文獻48-52
• 發(fā)表論文和參加科研工作情況52-53
• 致謝53-54
• 綜述54-59
• 參考文獻58-59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王淑芬,時云林,郭保忠,高徐生,滕翕和;約氏瘧原蟲配子體在小鼠外周血中自然消長觀察[J];動物學(xué)雜志;1984年06期

本文編號：524804