本文關(guān)鍵詞：miR-34a對樹突狀細(xì)胞發(fā)育和功能的影響及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miRNAs miR-34a 樹突狀細(xì)胞 IL-17a WNT1

【摘要】：microRNAs（miRNAs）是一類長度約為22個(gè)核苷酸，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與了眾多的生物學(xué)過程，如細(xì)胞的增殖分化和凋亡、個(gè)體發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)有的研究表明MiRNAs同樣參與了免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞的分化發(fā)育。為進(jìn)一步探討miRNAs在淋巴細(xì)胞發(fā)育和活化中的作用，通過建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型來進(jìn)一步研究miR-34a在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育中的作用。為此，首先我們通過q-PCR和流式分析鑒定miR-34a過表達(dá)的質(zhì)粒pMDH-PGK-GFP-miR-34a能成功表達(dá)miR-34a。在此基礎(chǔ)上，為更好的研究miR-34a對淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響，我們一方面通過制備miR-34a的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染骨髓干細(xì)胞，并建立miR-34a過表達(dá)嵌合小鼠模型，通過FACS和PCR檢測證明我們的嵌合小鼠模型成功建立。另一方面，為得到更好的穩(wěn)定的研究模型，我們將pMDH-PGK-GFP-miR-34a用HindIII酶切線性化，并應(yīng)用顯微注射受精卵細(xì)胞制備miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型。進(jìn)一步通過FACS分析發(fā)現(xiàn)：無論在嵌合小鼠中，還是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，我們均發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34a后，其T細(xì)胞亞群的比例和其在正常小鼠中發(fā)育無顯著差異。但我們發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中，無論是在骨髓還是在外周的脾臟中，均出現(xiàn)B細(xì)胞的顯著減少，這個(gè)結(jié)果和已發(fā)表文章結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型建立成功。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34a后，無論是在嵌合模型還是在轉(zhuǎn)基因模型中，樹突狀細(xì)胞(DC)及其各亞群細(xì)胞（pDC, cDC）都顯著高于其在正常小鼠體內(nèi)的比例。為了研究miR-34a是如何促進(jìn)DC的發(fā)育，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-34a并不影響DC細(xì)胞的自我更新和凋亡，而是通過促進(jìn)pre-DC向pDC和cDC發(fā)育來實(shí)現(xiàn)的。最后，我們通過軟件分析和PCR、熒光素酶素報(bào)告系統(tǒng)等預(yù)測和驗(yàn)證miR-34a在DC發(fā)育促進(jìn)中的作用機(jī)制，初步發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過作用于多種基因如E2F2、WNT1等來調(diào)控DC的發(fā)育。通過在轉(zhuǎn)基因骨髓細(xì)胞中過表達(dá)WNT1，并構(gòu)建WNT1和miR-34a的嵌合小鼠我們發(fā)現(xiàn)WNT1能夠逆轉(zhuǎn)由于過表達(dá)miR-34a導(dǎo)致的DC增多。這提示，WNT1是miR-34a的功能性靶基因。 我們進(jìn)一步通過體外共培養(yǎng)cDC和na ve CD4T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，，過表達(dá)miR-34a的cDC抑制了T細(xì)胞的增值。用同樣的方法我們發(fā)現(xiàn)miR-34a并不影響pDC對T細(xì)胞應(yīng)答。進(jìn)一步表明miR-34a不是通過影響cDC的抗原提呈和自身成熟來影響T的活化增殖。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-34a的cDC的IL-17a的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在正常cDC的表達(dá)。這提示miR-34a cDC對CD4T細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過IL-17a發(fā)揮作用的。為了驗(yàn)證是否確實(shí)是由于IL-17a導(dǎo)致的這種抑制作用，我們中和抗體中和共培養(yǎng)體系中的IL-17a，結(jié)果表明，中和IL-17a能明顯消除這種抑制作用。同樣我們在cDC與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入IL-17a，發(fā)現(xiàn)IL-17a能夠明顯的抑制T細(xì)胞的增殖。但單獨(dú)將IL-17a加入抗CD3、CD28活化的T細(xì)胞中卻不能抑制T細(xì)胞的活化。且流式結(jié)果表明IL-17a受體高表達(dá)在DC細(xì)胞表面。提示IL-17a直接作用于DC。有文獻(xiàn)報(bào)道，WNT1信號下游的一個(gè)接頭蛋白TCF1對IL-17a的表達(dá)有抑制作用，而TCF1有能夠抑制一個(gè)與IL-17a表達(dá)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，所以我們檢測了這兩種關(guān)鍵分子是否在這個(gè)過程中發(fā)揮作用，定量PCR表明TCF1在miR-34a cDC的表達(dá)明顯下調(diào)，而RORγt在cDC的表達(dá)明顯上調(diào)。這提示miR-34a可能通過影響WNT1介導(dǎo)的信號影響了DC產(chǎn)生IL-17a，從而影響DC對T細(xì)胞的活化。 總結(jié)我們現(xiàn)有的研究，我們成功建立了miR-34a過表達(dá)嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究miR-34a的生物學(xué)功能提供強(qiáng)有力的研究工具。免疫表型結(jié)果提示miR-34a主要促進(jìn)了pre-DC向pDC, cDC細(xì)胞的發(fā)育。miR-34a可能通過影響WNT1基因翻譯和穩(wěn)定來調(diào)控DC的發(fā)育。同時(shí)miR-34a通過對WNT1-TCF1-RORγT信號通路調(diào)控IL-17a表達(dá)，從而影響CD4T細(xì)胞的活化增殖。這為闡明DC發(fā)育的分子調(diào)控提供了新的理論解釋，也首次提出DC通過產(chǎn)生高水平的IL-17調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答，為免疫應(yīng)答的調(diào)控提出新的理論。
【關(guān)鍵詞】：miRNAs miR-34a 樹突狀細(xì)胞 IL-17a WNT1
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 目錄11-12
• 前言12-15
• 第一部分 miR-34a 小鼠骨髓嵌合模型與轉(zhuǎn)基因模型的建立15-31
• 一、材料方法15-25
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-29
• 三、討論29-31
• 第二部分 miR-34a 骨髓嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的表型分析31-42
• 一、材料方法31-33
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-41
• 三、討論41-42
• 第三部分 miR-34a 促進(jìn) DC 分化發(fā)育的功能靶基因分析驗(yàn)證42-53
• 一、材料方法42-46
• 二、結(jié)果46-51
• 三、討論51-53
• 第四部分 miR-34a 對 DC 功能影響的研究53-66
• 一、材料方法54-58
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-65
• 三、討論65-66
• 結(jié)論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 綜述71-83
• 參考文獻(xiàn)77-83
• 碩士期間完成論文83-84
• 名詞縮寫表84-86
• 致謝86-87

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本文編號：523831