本文關(guān)鍵詞：人源抗狂犬病毒基因工程抗體親和力成熟研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus, RV)引起的人獸共患疾病,發(fā)病后死亡率幾乎達(dá)百分之百。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)推薦,對(duì)狂犬�、蠹�(jí)暴露后的預(yù)防主要是采用狂犬疫苗注射結(jié)合抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin, RIG)的方法。目前使用的兩類RIG為人抗狂犬病毒免疫球蛋白(human rabies immune globulin, HRIG)和馬抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin, ERIG)。但ERIG副反應(yīng)比較嚴(yán)重,而且對(duì)某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制,HRIG價(jià)格昂貴,供應(yīng)量有限并且有潛在的病原威脅�？箍袢《締慰寺】贵w(monoclonal antibodies, mAbs)具有中和效果高,安全性好,成本低,可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),能夠取代RIG用于狂犬病的暴露后預(yù)防。 抗體體外親和力成熟主要是模擬體內(nèi)親和力成熟的過(guò)程,采取各種策略對(duì)抗體基因進(jìn)行相應(yīng)的突變,構(gòu)建突變抗體庫(kù),通過(guò)親和篩選獲得高親和力的抗體。在體外親和力成熟的過(guò)程中,突變策略主要可分為隨機(jī)突變、置換和定向突變。本研究以噬菌體表面展示技術(shù)為平臺(tái),分別通過(guò)易錯(cuò)突變和鏈置換的方法篩選高親和力的人源抗狂犬病毒中和抗體,實(shí)驗(yàn)有以下兩部分： 一、人源抗狂犬病毒scFv抗體易錯(cuò)庫(kù)的構(gòu)建與篩選 為獲得針對(duì)狂犬病毒糖蛋白II號(hào)表位的高親和力抗體,我們采用scFv噬菌體展示平臺(tái),對(duì)一株糖蛋白II號(hào)表位中和抗體RV08采用鏈置換法進(jìn)行改造。首先將母本抗體RV08的重鏈和輕鏈基因克隆入pHAL14載體,以此克隆作為模板進(jìn)行6-8輪易錯(cuò)PCR。用已隨機(jī)引入突變的質(zhì)粒構(gòu)建scFv噬菌體抗體庫(kù),使用高效噬菌體對(duì)scFv噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行包裝。在成功構(gòu)建scFv噬菌體抗體庫(kù)的基礎(chǔ)上,用純化的狂犬病毒顆粒CTN株對(duì)scFv噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選,利用ELISA、IFA對(duì)所獲人源單克隆抗體scFv段基因的功能特性進(jìn)行鑒定,并通過(guò)序列測(cè)定確定所獲抗體的基因序列,我們獲得90株抗狂犬病毒scFv抗體。 二、人源抗狂犬病毒全抗體表達(dá)及功能鑒定 將這90株抗體經(jīng)293T雙質(zhì)粒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IgG抗體,通過(guò)ELISA、IFA方法篩選到5株親和力較高的針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的抗體,通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定親和力。結(jié)果顯示這5株抗體親和力均能達(dá)到10-9M,對(duì)狂犬病毒CTN株具有良好的中和活性。其中,HL2、HL37和HL46親和力分別為1.56x10"9M,1.88x10-9M,1.30×10-9M,略高于RV08。5株抗體輕鏈和重鏈的CDR區(qū)均有氨基酸發(fā)生突變,但重鏈CDR3區(qū)均無(wú)突變發(fā)生,提示僅通過(guò)易錯(cuò)PCR的方法引入少量的突變堿基,很難獲得重鏈CDR3區(qū)有意義的氨基酸突變。 綜上所述,本研究運(yùn)用噬菌體易錯(cuò)抗體庫(kù)技術(shù),構(gòu)建了人源抗狂犬病毒scFv噬菌體抗體庫(kù),篩選獲得了90株特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的人源scFv抗體。其中5株構(gòu)建為IgG全抗體后顯示出高親和力。這一結(jié)果為實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的親和力成熟奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病毒 人源基因工程抗體 親和力成熟 噬菌體展示技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.9
【目錄】：

• 縮略說(shuō)明4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 人源抗狂犬病毒scFv抗體易錯(cuò)庫(kù)的構(gòu)建與篩選10-38
• 前言10-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-35
• 討論35-37
• 小結(jié)37-38
• 第二部分 人源抗狂犬病毒全抗體表達(dá)及其親和力成熟研究38-58
• 前言38-40
• 實(shí)驗(yàn)材料40-42
• 實(shí)驗(yàn)方法42-47
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 討論55-57
• 小結(jié)57-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 綜述62-71
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 攻讀碩士期間已發(fā)表文章71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：520980