本文關(guān)鍵詞：人源抗狂犬病毒基因工程抗體親和力成熟研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus, RV)引起的人獸共患疾病,發(fā)病后死亡率幾乎達(dá)百分之百。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)推薦,對狂犬�、蠹壉┞逗蟮念A(yù)防主要是采用狂犬疫苗注射結(jié)合抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin, RIG)的方法。目前使用的兩類RIG為人抗狂犬病毒免疫球蛋白(human rabies immune globulin, HRIG)和馬抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin, ERIG)。但ERIG副反應(yīng)比較嚴(yán)重,而且對某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制,HRIG價(jià)格昂貴,供應(yīng)量有限并且有潛在的病原威脅。抗狂犬病毒單克隆抗體(monoclonal antibodies, mAbs)具有中和效果高,安全性好,成本低,可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),能夠取代RIG用于狂犬病的暴露后預(yù)防。 抗體體外親和力成熟主要是模擬體內(nèi)親和力成熟的過程,采取各種策略對抗體基因進(jìn)行相應(yīng)的突變,構(gòu)建突變抗體庫,通過親和篩選獲得高親和力的抗體。在體外親和力成熟的過程中,突變策略主要可分為隨機(jī)突變、置換和定向突變。本研究以噬菌體表面展示技術(shù)為平臺,分別通過易錯突變和鏈置換的方法篩選高親和力的人源抗狂犬病毒中和抗體,實(shí)驗(yàn)有以下兩部分： 一、人源抗狂犬病毒scFv抗體易錯庫的構(gòu)建與篩選 為獲得針對狂犬病毒糖蛋白II號表位的高親和力抗體,我們采用scFv噬菌體展示平臺,對一株糖蛋白II號表位中和抗體RV08采用鏈置換法進(jìn)行改造。首先將母本抗體RV08的重鏈和輕鏈基因克隆入pHAL14載體,以此克隆作為模板進(jìn)行6-8輪易錯PCR。用已隨機(jī)引入突變的質(zhì)粒構(gòu)建scFv噬菌體抗體庫,使用高效噬菌體對scFv噬菌體抗體庫進(jìn)行包裝。在成功構(gòu)建scFv噬菌體抗體庫的基礎(chǔ)上,用純化的狂犬病毒顆粒CTN株對scFv噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選,利用ELISA、IFA對所獲人源單克隆抗體scFv段基因的功能特性進(jìn)行鑒定,并通過序列測定確定所獲抗體的基因序列,我們獲得90株抗狂犬病毒scFv抗體。 二、人源抗狂犬病毒全抗體表達(dá)及功能鑒定 將這90株抗體經(jīng)293T雙質(zhì)粒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IgG抗體,通過ELISA、IFA方法篩選到5株親和力較高的針對狂犬病毒糖蛋白的抗體,通過非競爭ELISA方法測定親和力。結(jié)果顯示這5株抗體親和力均能達(dá)到10-9M,對狂犬病毒CTN株具有良好的中和活性。其中,HL2、HL37和HL46親和力分別為1.56x10"9M,1.88x10-9M,1.30×10-9M,略高于RV08。5株抗體輕鏈和重鏈的CDR區(qū)均有氨基酸發(fā)生突變,但重鏈CDR3區(qū)均無突變發(fā)生,提示僅通過易錯PCR的方法引入少量的突變堿基,很難獲得重鏈CDR3區(qū)有意義的氨基酸突變。 綜上所述,本研究運(yùn)用噬菌體易錯抗體庫技術(shù),構(gòu)建了人源抗狂犬病毒scFv噬菌體抗體庫,篩選獲得了90株特異性針對狂犬病毒糖蛋白的人源scFv抗體。其中5株構(gòu)建為IgG全抗體后顯示出高親和力。這一結(jié)果為實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的親和力成熟奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病毒 人源基因工程抗體 親和力成熟 噬菌體展示技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373.9
【目錄】：

• 縮略說明4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 人源抗狂犬病毒scFv抗體易錯庫的構(gòu)建與篩選10-38
• 前言10-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-35
• 討論35-37
• 小結(jié)37-38
• 第二部分 人源抗狂犬病毒全抗體表達(dá)及其親和力成熟研究38-58
• 前言38-40
• 實(shí)驗(yàn)材料40-42
• 實(shí)驗(yàn)方法42-47
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 討論55-57
• 小結(jié)57-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 綜述62-71
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 攻讀碩士期間已發(fā)表文章71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：520980