本文關(guān)鍵詞：A族鏈球菌上調(diào)A20表達(dá)以抑制巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：A族鏈球菌（GroupAstreptococcus，GAS）即化膿性鏈球菌，一類重要的G+致病菌，它可以引起多種不同的化膿性疾病和非化膿性感染后遺癥的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞是固有免疫中的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過其模式識別受體（PRR）與細(xì)菌表面的病原相關(guān)分子模式（PAMPs）結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)。其中模式識別受體TLR活化后可以與接頭蛋白MyD88作用，進(jìn)一步激活TRAF6來調(diào)節(jié)NF-KB和MAPKs信號通路。NF-κB激活后轉(zhuǎn)位入核，通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子、急性期蛋白和細(xì)胞因子等多種物質(zhì)的表達(dá)來調(diào)控免疫反應(yīng)以適應(yīng)細(xì)胞生存。鋅指蛋白A20是一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子，在多種細(xì)胞受到LPS、TNF、CD40等刺激后可大量表達(dá)，以發(fā)揮雙重泛素化酶作用。既能介導(dǎo)目的蛋白被蛋白酶體降解，又能抑制泛素化依賴信號的傳導(dǎo)。其泛素化作用的底物包括：TRAF2、TRAF6、IKK、Caspase8、RIP1等。本室前期研究表明：GAS作為G+菌其活化巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)較G-菌微弱而遲滯，同時還伴隨負(fù)調(diào)節(jié)蛋白A20的高表達(dá)。1為了探究這種高表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，是否與其導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)低下相關(guān)，本研究中以E.coli作為G-菌的對照，GAS刺激鼠源巨噬細(xì)胞RAW267.4后分別檢測細(xì)胞因子、NF-κB、TRAF6及A20在不同時間點(diǎn)核酸以及蛋白水平表達(dá)的差異。2為進(jìn)一步證實(shí)A20高表達(dá)與炎癥反應(yīng)低下有關(guān)，A20SiRNA借助脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，通過形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC)，特異性的降解A20的mRNA，從而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄后基因沉默。3用GAS感染A20SiRNA預(yù)處理后RAW264.7細(xì)胞，檢測細(xì)胞因子、NF-κB、TRAF6基因和蛋白水平的變化，對比A20SiRNA預(yù)處理組和不同對照組之間的差異，，為GAS感染后通過巨噬細(xì)胞介導(dǎo)微弱而遲緩的炎癥反應(yīng)，來逃避宿主固有免疫系統(tǒng)的清除作用提供理論依據(jù)。4為了探究GAS感染巨噬細(xì)胞后A20的高表達(dá)是否與MyD88通路激活相關(guān)，用GAS或E.coli刺激MyD88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞后，應(yīng)用Westernblot檢測NF-κB、TRAF6、A20表達(dá)的變化。 方法： 1RAW264.7細(xì)胞分別接受GAS或E.coli刺激，用Real-time PCR、CBA檢測細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10的動態(tài)表達(dá)變化。 2應(yīng)用Western blot檢測NF-κB、TRAF6、A20在GAS或E.coli分別刺激RAW264.7細(xì)胞和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞后不同時間點(diǎn)的變化情況。 3應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，借助脂質(zhì)體將A20SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞而后GAS感染，行Western blot、BCA、Real-time PCR分別檢測A20特異性的干擾后NF-κB、TRAF6以及細(xì)胞因子蛋白和基因水平的變化。 4GAS或E.coli刺激MyD88-/-C57BL/6鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot檢測NF-κB、TRAF6、A20表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1Real-time PCR檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況：GAS刺激組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)在7小時以內(nèi)低于E.coli刺激組，而IL-10的量卻高于E.coli組。其中炎癥因子：IL-1β、TNF-α分別都在3-5小時達(dá)高峰；而IL-6、IL-10的量分別在7小時左右達(dá)高峰 2CBA檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)：GAS刺激組在各個時間點(diǎn)細(xì)胞因子的表達(dá)量都比E.coli刺激組低，這與Real-time PCR的檢測結(jié)果基本一致。 3Western blot檢測GAS或E.coli分別刺激RAW264.7細(xì)胞后NF-κB、TRAF6、A20的變化：GAS刺激后，A20從2小時開始表達(dá)明顯升高，6、8小時達(dá)高峰；E.coli刺激后，A20從4小時開始表達(dá)，6、8小時達(dá)高峰。并且GAS刺激A20的表達(dá)明顯高于E.coli刺激組，而A20所調(diào)控的下游分子TRAF6，以及核轉(zhuǎn)錄因子P65的表達(dá)則相應(yīng)降低，在GAS刺激組低于E.coli刺激組。用C57BL/6鼠的BMDM細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致且更為明顯。 4A20SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，隨后，以等量GAS刺激該細(xì)胞以檢測： A20、TRAF6及P65的表達(dá)，結(jié)果顯示，A20SiRNA瞬時轉(zhuǎn)入RAW264.7細(xì)胞后，無論基因水平還是蛋白水平檢測不到A20的表達(dá)。該細(xì)胞受GAS刺激后，P65、TRAF6表達(dá)顯著升高，且炎癥反應(yīng)劇烈，細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10表達(dá)明顯升高。 5Western blot檢測MyD88-/-C57鼠和野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞受GAS和E.coli刺激后A20的表達(dá)，結(jié)果顯示：盡管MyD88-/-C57鼠BMDM細(xì)胞受到刺激，A20幾乎不表達(dá)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生C57BL/6鼠BMDM細(xì)胞受到刺激后的高表達(dá)。 結(jié)論： 1GAS作為G+菌其活化巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)較G-菌微弱而遲滯，這與負(fù)調(diào)節(jié)蛋白A20的高表達(dá)有關(guān)。 2負(fù)調(diào)節(jié)蛋白A20通過與底物TRAF6作用，抑制泛素化依賴信號的傳導(dǎo)，從而下調(diào)NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 3GAS刺激鼠源巨噬細(xì)胞后，A20的高表達(dá)是依賴于TLRs的下游MyD88通路的活化。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 A族鏈球菌 NF-κB 促炎癥因子 A20 TRAF6
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-11
• 材料與方法11-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 綜述37-46
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 致謝46-47
• 個人簡歷47-48

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：510324