本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis)至今仍然是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題,數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人受其威脅。主要是由血吸蟲(chóng)(Schistosome)尾蚴感染而引起的一種寄生蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)病的防治方法仍然以吡喹酮的給藥治療為主,但是目前已有報(bào)道長(zhǎng)期使用吡喹酮可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗藥性。因此目前發(fā)展高效、安全的疫苗是持續(xù)控制血吸蟲(chóng)病的一種理想的研究方向。細(xì)胞凋亡是由多基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡對(duì)維持生物體正常的生長(zhǎng)發(fā)育以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。本課題組前期的研究表明,不同適宜性宿主來(lái)源的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)在形態(tài)、發(fā)育以及蟲(chóng)體細(xì)胞凋亡現(xiàn)象方面都存在顯著的差別,推測(cè)細(xì)胞凋亡可以影響日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育。BAD 是 Bcl-2 相關(guān)的死亡啟動(dòng)子(bcl-2 associated death promoter),.屬于 Bcl-2家族的促凋亡基因,僅含有BH3。本文SjBAD的基因序列來(lái)自歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL,http://www.ebi.ac.uk/),基因編號(hào)為 SjD AY814710.1,設(shè)計(jì)特異引物,選用42d蟲(chóng)體cDNA為模板。PCR擴(kuò)增,克隆了日本血吸蟲(chóng)SjBADORF編碼的部分基因,長(zhǎng)度為594bp,編碼197個(gè)氨基酸。選用pET-28a(+),構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjBAD,并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,成功誘導(dǎo)了重組蛋白pET-28a(+)-SjBAD,分子質(zhì)量約為27kDa。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明SjBAD基因在日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體的各個(gè)發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄,在14d蟲(chóng)體中表達(dá)量最高,隨后隨著蟲(chóng)體的生長(zhǎng),相對(duì)表達(dá)量逐漸降低,在42d雄蟲(chóng)的表達(dá)量高于雌蟲(chóng)。Western blotting分析表明重組SjBAD具有較好的抗原性和免疫原性。間接ELISA分析表明重組蛋白免疫小鼠產(chǎn)生了高水平的特異性IgG抗體。動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明,同PBS對(duì)照組相比較,重組蛋白SjBAD在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了 27.50%和33.57%的減蟲(chóng)率,及39.80%和42.06%的肝臟蟲(chóng)卵減少率,差異都非常顯著。成功構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SjBAD,并將其轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)表明SjBAD在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36h表達(dá)量最高,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD能夠促進(jìn)293T細(xì)胞凋亡。本文為深入開(kāi)展SjBAD的生物學(xué)功能研究,及篩選針對(duì)SjBAD的藥物靶標(biāo)提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲(chóng) 細(xì)胞凋亡 BAD
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R383.24
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 英文縮略詞表9-11
• 前言11-12
• 第一篇 緒論12-22
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1 血吸蟲(chóng)病與血吸蟲(chóng)的生活史12-13
• 1.1 血吸蟲(chóng)病12
• 1.2 血吸蟲(chóng)的生活史12-13
• 2 細(xì)胞凋亡概述13-14
• 2.1 細(xì)胞凋亡與死亡13
• 2.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的三種途徑13-14
• 3 Bcl-2蛋白家族和BAD蛋白14-15
• 3.1 Bcl-2蛋白家族14
• 3.2 BAD蛋白14-15
• 4 血吸蟲(chóng)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展15
• 5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)15-16
• 5.1 形態(tài)學(xué)的檢測(cè)15
• 5.2 DNA斷裂檢測(cè)分析15-16
• 5.3 凋亡相關(guān)因子的檢測(cè)16
• 5.4 流式細(xì)胞儀分析(flow cytometry assay,FCA)檢測(cè)細(xì)胞凋亡16
• 6 本研究的總體研究思路16-17
• 參考文獻(xiàn)17-22
• 第二篇 試驗(yàn)研究22-62
• 第二章 日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD的原核克隆表達(dá)及免疫保護(hù)效果評(píng)估22-48
• 1 材料與方法22-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料22-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-35
• 2 試驗(yàn)結(jié)果35-44
• 2.1 日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD的克隆表達(dá)及生物信息學(xué)分析35-37
• 2.2 Real-time PCR檢測(cè)SjBAD在不同時(shí)期日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平37-38
• 2.3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SjBAD的構(gòu)建及鑒定38-39
• 2.4 重組蛋白SjBAD的表達(dá)與分析39-41
• 2.5 Western blotting檢測(cè)重組蛋白SjBAD的抗原性和免疫原性41-42
• 2.6 重組蛋白SjBAD免疫保護(hù)效果評(píng)估42-43
• 2.7 ELISA檢測(cè)重組蛋白SjBAD誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的特異性IgG抗體水平43-44
• 3 討論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 第三章 日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD真核克隆表達(dá)及相關(guān)功能研究48-62
• 1 材料與方法48-54
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料48-50
• 1.2 試驗(yàn)方法50-54
• 2 試驗(yàn)結(jié)果54-60
• 2.1 日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD的擴(kuò)增54-55
• 2.2 構(gòu)建與鑒定真核表達(dá)重組質(zhì)粒pMD-19T-SjBAD55-56
• 2.3 真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SjBAD的構(gòu)建與鑒定56-57
• 2.4 293T細(xì)胞的培養(yǎng)57
• 2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SjBAD在293T細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平57-58
• 2.6 細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)促凋亡基因SjBAD的作用58-60
• 3 討論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-62
• 全文總結(jié)62-64
• 致謝64-66
• 論文發(fā)表情況66

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