本文關(guān)鍵詞：結(jié)核病亞單位疫苗LT84的克隆表達(dá)與純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：結(jié)核分枝桿菌可以在人體內(nèi)長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài),當(dāng)人體免疫功能下降時(shí)恢復(fù)生長(zhǎng)活性,引起活動(dòng)性肺結(jié)核,這是結(jié)核病難以根治的主要原因。RpfD(復(fù)蘇因子D)作為一種結(jié)核分枝桿菌休眠期分泌的蛋白,其主要作用在于促進(jìn)休眠狀態(tài)的細(xì)菌復(fù)蘇,同時(shí)它能引起機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。作為結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原之一,RpfD被發(fā)現(xiàn)對(duì)正處于復(fù)蘇狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌有較強(qiáng)的免疫活性。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期篩選的結(jié)核亞單位疫苗ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX中融合插入RpfD的編碼基因Rv2389c,構(gòu)建新型結(jié)核亞單位多期融合蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX(EARMMH, LT84),以改善原有的結(jié)核亞單位疫苗的免疫原性,尤其是對(duì)復(fù)蘇期結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生免疫作用。 方法：通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室己構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET30a-ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX加以改造,利用Bgl Ⅱ單酶切位點(diǎn)插入RpfD的編碼基因Rv2389c,構(gòu)建全新的重組質(zhì)粒pET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX;經(jīng)測(cè)序鑒定確認(rèn)目的基因連接成功后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)載體大腸埃希菌BL21中,選擇適宜條件誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白LT84。目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件為：溫度34℃,IPTG終濃度0.5mmol/L,搖床180RPM,誘導(dǎo)時(shí)間4h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后,利用蛋白電泳分析鑒定目的蛋白是否表達(dá)。純化融合蛋白LT84時(shí)首先進(jìn)行鹽析,所得沉淀使用PB緩沖液重懸,然后使用GE公司蛋白純化儀和疏水柱,進(jìn)行上樣蛋白樣品的純化,以獲得目的蛋白LT84。得到純化的蛋白樣品后,使用分光光度計(jì)測(cè)量蛋白樣品0D值推算濃度。 結(jié)果：構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX;測(cè)序鑒定無(wú)變異,利用BL21大腸桿菌表達(dá)載體在IPTG終濃度0.5mmol/L,34℃,搖床180RPM,誘導(dǎo)時(shí)間4h條件下成功誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白表達(dá)于上清之中。使用飽和硫酸銨溶液對(duì)目的蛋白進(jìn)行鹽析鹽析濃度為2%,時(shí)間為12h；鹽析所的產(chǎn)物使用蛋白純化儀和GE healthcare疏水柱純化,得到純化的融合蛋白EARMMH(LT84)。經(jīng)蛋白電泳鑒定后,使用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白樣品濃度為0.755mg/ml. 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX,并在適宜的條件下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白EARMMH(LT84),使用鹽析及疏水層析純化了獲得了目的蛋白,得到濃度為0.755mg/ml的重組融合蛋白EARMMH(LT84),為進(jìn)一步研究結(jié)核亞單位疫苗提供了新疫苗和備選對(duì)象。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 亞單位疫苗 RpfD ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R52;R392.11
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-10
• 中英文詞匯對(duì)照10-12
• 1. 前言12-15
• 1.1 結(jié)核病流行的歷史與現(xiàn)況12-13
• 1.2 抗結(jié)核疫苗的現(xiàn)況13
• 1.3 生物工程亞單位疫苗的顯著優(yōu)點(diǎn)13
• 1.4 構(gòu)建多期亞單位疫苗的意義13-15
• 2. 材料與試劑15-18
• 2.1 主要材料15
• 2.2 主要儀器設(shè)備15-16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑16-18
• 2.3.1 培養(yǎng)基16
• 2.3.2 各種活性酶16
• 2.3.3 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白EARMMH(LT84)所需試劑16-18
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法18-26
• 3.1 重組質(zhì)粒pET30a-EARMMH(LT84)的構(gòu)建18-23
• 3.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成19-20
• 3.1.2 目的基因的擴(kuò)增20-21
• 3.1.3 目的基因片段的單酶切及純化21
• 3.1.4 載體質(zhì)粒的單酶切及去磷酸化21-22
• 3.1.5 目的基因片段與載體質(zhì)粒的連接22-23
• 3.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備23
• 3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞23
• 3.4 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的篩選與鑒定23-24
• 3.5 重組融合蛋白EARMMH(LT84)的誘導(dǎo)與表達(dá)24
• 3.6 重組蛋白EARMMH(LT84)的純化24-25
• 3.7 蛋白濃度的測(cè)定25-26
• 4. 結(jié)果26-35
• 4.1 載體質(zhì)粒提取結(jié)果26
• 4.2 目的基因擴(kuò)增結(jié)果26-27
• 4.3 PCR產(chǎn)物純化結(jié)果27
• 4.4 載體質(zhì)粒單酶切結(jié)果27-28
• 4.5 連接前目的基因片段與載體質(zhì)粒對(duì)比28
• 4.6 PCR驗(yàn)證結(jié)果28-29
• 4.7 重組質(zhì)粒pET30a-EARMMH測(cè)序結(jié)果29-30
• 4.8 陽(yáng)性單克隆菌落質(zhì)粒提取結(jié)果30
• 4.9 重組蛋白LT84的誘導(dǎo)表達(dá)30-32
• 4.10 目的蛋白鹽析結(jié)果32-33
• 4.11 重組蛋白LT84的純化33-34
• 4.12 重組蛋白LT84的濃度測(cè)定結(jié)果34-35
• 5. 討論35-39
• 5.1 研發(fā)新型亞單位疫苗的前景及意義35
• 5.2 亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)35-36
• 5.3 亞單位疫苗組成抗原的選取和各自特點(diǎn)36-38
• 5.4 其它類型亞單位疫苗的特點(diǎn)38-39
• 5.5 構(gòu)建亞單位疫苗LT84的目的39
• 6. 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述44-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間參與課題與論文60-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王建發(fā);張敏;林玉才;;植物血凝素的研究應(yīng)用[J];北方牧業(yè);2008年08期

2 姜云峰;;山西某農(nóng)村居民結(jié)核病防治知識(shí)調(diào)查分析[J];長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年06期

3 王敏;張鳳芹;于文建;;肺結(jié)核的辨證分型治療研究與調(diào)護(hù)[J];光明中醫(yī);2008年09期

4 劉賢杰;朱中元;曾會(huì)才;;結(jié)核分支桿菌蛋白抗原表位研究進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2008年10期

5 吳小林;;結(jié)核病藥物研發(fā)的進(jìn)展、挑戰(zhàn)和展望[J];國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè));2010年03期

6 范清琪;張繼明;;利奈唑胺治療耐藥結(jié)核的研究進(jìn)展[J];世界臨床藥物;2013年07期

7 魏增泉;劉明亮;;治療耐藥結(jié)核病氟喹諾酮的藥動(dòng)/藥效學(xué)性質(zhì)及展望[J];國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè));2012年06期

8 J.A.Caminero;夏輝;劉宇紅;;耐多藥結(jié)核病:流行病學(xué),危險(xiǎn)因素及病人發(fā)現(xiàn)[J];國(guó)際結(jié)核病與肺部疾病雜志;2010年04期

9 呂華坤,許衛(wèi)國(guó),王蓓;人類結(jié)核菌疫苗研究進(jìn)展[J];江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué);2004年02期

10 葉佳慶;何旺瑞;;健康促進(jìn)干預(yù)提高結(jié)核病人發(fā)現(xiàn)率分析[J];江西醫(yī)藥;2010年01期

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核病亞單位疫苗LT84的克隆表達(dá)與純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：497793