本文關(guān)鍵詞：通過優(yōu)化Kex2 P1’位點(diǎn)在畢赤酵母中高效表達(dá)重組蛋白SCF，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：如今，，重組蛋白的研究已經(jīng)日趨成熟，各種蛋白表達(dá)體系也被不斷完善，其中巴斯德畢赤酵母作為經(jīng)典蛋白表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用。畢赤酵母具有生長(zhǎng)速率高，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，毒性小，污染少，分泌出蛋白構(gòu)象完整，活性高等優(yōu)點(diǎn)，但其蛋白分泌水平不穩(wěn)定也成為生產(chǎn)和科研的一大難題。本文針對(duì)酵母分泌不穩(wěn)定的問題，優(yōu)化了畢赤酵母Kex2P1’位點(diǎn)氨基酸，從而使Kex2切割信號(hào)肽的效率明顯提高，大量增加畢赤酵母分泌蛋白量。 為了利于篩選出高表達(dá)的突變株，本研究將報(bào)告基因Luciferase整合到表達(dá)載體pPICZαA中，使其與目的基因融合，在適宜的條件下共同表達(dá)，從而通過Luciferase報(bào)告基因的表達(dá)情況，間接標(biāo)定目的蛋白的表達(dá)情況。熒光素酶在ATP，Mg2+，O2存在的下，與特異的熒光素酶底物反應(yīng)，釋放出光子，從而可以通過熒光照度計(jì)對(duì)熒光值進(jìn)行定量的檢測(cè)。由于報(bào)告基因Luciferase與目的基因?qū)儆谌诤媳磉_(dá)，通過熒光值的高低篩選出高表達(dá)的突變株，用于后續(xù)的目的基因表達(dá)及純化。 本研究在優(yōu)化畢赤酵母Kex2P1’位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)干細(xì)胞因子SCF進(jìn)行了大量表達(dá)及純化。SCF作為重要的造血干細(xì)胞因子，其功能作用主要是通過與e-kit受體相結(jié)合，刺激肥大細(xì)胞的增殖，協(xié)調(diào)其他生長(zhǎng)因子維持祖細(xì)胞、造血細(xì)胞存活，對(duì)細(xì)胞數(shù)量集落的增加、定向分化以及粘附起著重要的作用。本文以pPICZα-A作為載體，通過分子克隆手段對(duì)pPICZα-A進(jìn)行改造，優(yōu)化Kex2P1’位點(diǎn)氨基酸，使SCF大量表達(dá)，并通過多步純化，最后得到活性較高的SCF。
【關(guān)鍵詞】：畢赤酵母 Kex2 P1’位點(diǎn) SCF 表達(dá)與純化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 緒論9-16
• 1.1 大腸桿菌表達(dá)體系9-10
• 1.2 畢赤巴斯德酵母10-13
• 1.2.1 畢赤巴斯德酵母載體的基本組成10-11
• 1.2.2 酵母分泌蛋白機(jī)制11-12
• 1.2.3 Kex2 的研究進(jìn)展12-13
• 1.3 干細(xì)胞因子（Stem cell factor）研究進(jìn)展13-14
• 1.3.1 干細(xì)胞因子（SCF）生物活性及作用機(jī)制13
• 1.3.2 干細(xì)胞因子（SCF）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)13-14
• 1.4 立題依據(jù)14-15
• 實(shí)驗(yàn)流程圖15-16
• 第2章 Kex2 P1’位點(diǎn)的優(yōu)化及 SCF 重組蛋白的表達(dá)16-48
• 2.1 材料與方法16-32
• 2.1.1 材料16-20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-46
• 2.2.1 酵母重組載體構(gòu)建及優(yōu)化過程32-39
• 2.2.2 重組蛋白 SCF 的鑒定39-41
• 2.2.3 重組蛋白 SCF 的純化41-44
• 2.2.4 SCF 蛋白濃度的測(cè)定44
• 2.2.5 重組蛋白 SCF 活力測(cè)定44-45
• 2.2.6 SCF 大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)及 Ni 親和層析純化45-46
• 2.3 討論46-48
• 2.3.1 表達(dá)載體的選擇及改造46
• 2.3.2 報(bào)告基因 Luciferase46
• 2.3.3 SCF 的制備46-48
• 第3章 研究總結(jié)48-49
• 3.1 本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果48
• 3.2 本研究的創(chuàng)新之處48
• 3.3 擬進(jìn)一步的研究方案48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 作者介紹53
• 已發(fā)表論文53-54
• 致謝54

【參考文獻(xiàn)】

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1 潘s

本文編號(hào)：484015