本文關(guān)鍵詞：腳橋被蓋核深部電刺激對帕金森病模型大鼠步態(tài)調(diào)節(jié)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的漸進性神經(jīng)退行性疾病,主要病理特點為中腦的黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神經(jīng)元退化,臨床上表現(xiàn)為肢體靜止性震顫、僵直、運動遲緩等運動功能紊亂。步態(tài)不穩(wěn)也是PD患者晚期常見的運動癥狀之一,患者走路速度越來越慢,上肢擺動減少,啟步困難,步幅減小(小碎步),呈慌張步態(tài),常常引起患者行走時跌倒,嚴重影響著患者的生活質(zhì)量。 腦深部電刺激術(shù)(deep brain stimulation, DBS)是通過立體定向手術(shù)將刺激電極植入患者特定的深部腦神經(jīng)核團,對核團進行刺激,調(diào)節(jié)引起癥狀的異常電活動,從而改善患者的癥狀,達到治療效果。DBS是目前治療晚期PD患者最佳的外科方法,尤其是藥物難治性PD治療中取得了顯著的臨床效果。 目前常用于PD的DBS治療的靶點主要有三個：丘腦腹外側(cè)中間核(ventral intermediate nucleus, Vim)、蒼白球內(nèi)側(cè)部(globus pallidus internus, GPi)及丘腦底核(subthalamic nucl eus, STN)。靶點的選擇,主要取決于PD患者將要治療的主要癥狀,根據(jù)患者的主要臨床癥狀,進行靈活地選擇靶點。一般來講,Vim的DBS治療能很有效改善PD患者的震顫和肌僵直,但對運動遲緩效果欠佳；Gpi是毀損手術(shù)治療PD最常用的靶點,對肌僵直、運動遲緩改善效果較好,但對震顫治療效果不佳,同時Gpi的DBS治療也能有效改善PD患者對側(cè)肢體的震顫、強直、運動遲緩,但對步態(tài)姿勢等中軸癥狀改善較少；STN對運動環(huán)路的間接通道上的Gpi和SNr都有調(diào)節(jié),是目前PD患者DBS治療最常用的首選靶點,對肌強直、運動遲緩、震顫均有效,并可以明顯減少PD患者的左旋多巴用量,但對姿勢不穩(wěn)、步態(tài)障礙等軸性癥狀改善較小 近年來的臨床研究提示腳橋核(pedunculopontine nucleus, PPN)電刺激可以有效改善晚期PD患者的運動癥狀,尤其對步態(tài)不穩(wěn)、姿勢障礙等軸性癥狀有明顯療效。有研究表明,PD狀態(tài)下,PPN的神經(jīng)元發(fā)生變性、凋亡,殘余神經(jīng)元放電不規(guī)則,代償性地異常過度放電；低頻電刺激PPN能顯著改善PD患者的姿勢不穩(wěn)和步態(tài)障礙,提示PPN參與運動功能的調(diào)節(jié)。PPN已經(jīng)成為DBS治療PD患者的步態(tài)紊亂和姿勢不穩(wěn)的新靶點。 應(yīng)用神經(jīng)毒素6-羥多巴胺(6-hydroxy dopamine,6-OHDA)制成PD模型大鼠來研究PD的病理生理,以及各種治療方法的療效評估的技術(shù)已經(jīng)成熟并應(yīng)用廣泛。既往有很多的行為學(xué)方法來驗證PD模型大鼠和評估治療效果,比如,跑臺測試、圓柱體試驗(前肢不對稱試驗)、轉(zhuǎn)棒試驗、平衡木行走試驗、階梯行走試驗、腳印分析等。但是這些方法有的只局限于前肢功能測試,有的限制于強迫性運動,有的只能測試單一的動態(tài)參數(shù)或者靜態(tài)參數(shù),并且人工記錄的主觀性影響和重復(fù)測試引起的誤差較大。與其它行為學(xué)測試方法相比較,Catwalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)可以同時檢測大鼠的四只腳爪的動態(tài)的和靜態(tài)的參數(shù)以及四只腳爪間的協(xié)調(diào)性,同時檢測的是大鼠的自發(fā)運動行為,計算機系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集和離線分析也避免了人工記錄的主觀性影響。因此,越來越多的學(xué)者關(guān)注并運用Catwalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)來評價各種實驗動物模型的行為學(xué)特征和評估治療效果。 大鼠的腳橋被蓋核(pedunculopontine tegmental nucleus, PPTg)相當(dāng)于人類的PPN。那么,6-OHDA制成的PD模型大鼠的步態(tài)會有什么樣變化?PPTg-DBS對PD模型大鼠的步態(tài)是否也有改善作用呢?本實驗擬用Catwalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)來評估PPTg-DBS對PD模型大鼠的步態(tài)作用效果,為進一步研究PPN-DBS改善PD步態(tài)的作用機制提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。 目的： 應(yīng)用客觀的Catwalk自動步態(tài)分析系統(tǒng),觀察6-OHDA制成的偏側(cè)PD模型大鼠的步態(tài)參數(shù)變化；并且運用Catwalk系統(tǒng)檢測經(jīng)腳橋被蓋核(PPTg)電刺激治療后的偏側(cè)PD模型大鼠的步態(tài)參數(shù)變化情況,為進一步研究PPN-DBS改善PD步態(tài)障礙的作用機理建立動物模型,提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。方法： 1、實驗分組： 成年健康雄性SPF級的Sprague Dawley (SD)大鼠27只,體重控制在280g-320g之間,隨機分為3組：假手術(shù)組(n=6),使用立體定向術(shù)在大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)縱束(medial forebrain bundle, MFB)注射生理鹽水；6-OHDA組(n=6),同側(cè)注射等量的6-OHDA制成偏側(cè)PD模型大鼠；6-OHDA+電極組(n=15),同側(cè)注射等量6-OHDA同時將刺激電極植入同側(cè)PPTg。 2、大鼠的Catwalk適應(yīng)性訓(xùn)練： 所有大鼠在立體定向手術(shù)前進行Catwalk適應(yīng)性訓(xùn)練1周。將大鼠置入Catwalk通道,訓(xùn)練其自發(fā)連續(xù)不停頓地通過通道,每只大鼠早晚各訓(xùn)練一次,每次來回跑過通道3次～5次,整個實驗訓(xùn)練在暗室中完成。訓(xùn)練合格標(biāo)準為：大鼠需連續(xù)不停頓地通過通道,次數(shù)至少三次。訓(xùn)練合格后,采集Catwalk數(shù)據(jù)作為基線值。 3、模型的制作和刺激電極的植入： 將假手術(shù)組的大鼠麻醉后固定在立體定向儀上,根據(jù)Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)縱束(MFB)坐標(biāo)：齒桿低于耳桿3.4mm,前囟后1.8mm,旁開2.0mm,硬膜下8.3mm,按坐標(biāo)將微量注射器緩慢進針到預(yù)定深度,緩慢注射4u1含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。6-OHDA組則注射10ug/4ul的6-OHDA溶液(用含有0.02%抗壞血酸的生理鹽水溶解),其它步驟均一樣。 6-OHDA+電極組的大鼠除了以上注射6-OHDA外,還同時在顯微鏡下植入刺激電極,根據(jù)圖譜確定PPTg的坐標(biāo)：前囟后7.9mm,旁開2.1mm,硬膜下7.0mmm。植入后用牙科水泥固定。電極植入后用牙科水泥固定。電極的顱骨外側(cè)端焊接著插座,可以與刺激電線的插口連接。大鼠術(shù)后1周恢復(fù)期給予自由飲食飲水,恢復(fù)后仍給予飲食控制,每只每天12-14g,飲水不限,以保持體重。 4、Catwalk的數(shù)據(jù)采集： Catwalk的數(shù)據(jù)采集時間分別為：所有大鼠在Catwalk訓(xùn)練合格后采集作為基線；立體定向手術(shù)后4周再次進行Catwalk自動步態(tài)分析檢測。6-OHDA+電極組大鼠在PPTg-DBS前后分別進行Catwalk數(shù)據(jù)采集。 5、PPTg-DBS: 6-OHDA+電極組大鼠在帶線關(guān)機和帶線開機的情況下分別進行Catwalk自動步態(tài)檢測。刺激參數(shù)：頻率25Hz,脈寬80us,幅值2-6V。每只大鼠的刺激幅值為個體刺激閾值的80%。每只大鼠從2V開始給予刺激,每0.1V向上調(diào),直到出現(xiàn)刺激副作用時(比如,大鼠身體扭轉(zhuǎn)至一側(cè)或者頭部抖動等)的幅值為個體的刺激閾值。 6、組織化學(xué)： 全部的步態(tài)檢測后,大鼠常規(guī)麻醉,并通過刺激電極接通刺激器,給予強電壓通電,使得電極尖端在腦組織上留下針道痕跡,以便確定刺激電極的尖端的位置。開胸心臟灌注生理鹽水沖洗,灌注4%多聚甲醛溶液固定,取腦組織置于4%多聚甲醛浸泡固定過夜,再置于25%蔗糖溶液中脫水,直至腦組織完全下沉。固定及脫水后的腦組織里進行冰凍切片,取黑質(zhì)部和中腦腳橋被蓋核處的切片分別進行TH免疫組化染色和尼氏染色以確定黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元毀損情況和電極是否植入腳橋被蓋核位置。 7、統(tǒng)計學(xué)方法： 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料用“均數(shù)±標(biāo)準差”表示,兩組均數(shù)間的比較采用兩獨立樣本t檢驗；立體定向術(shù)前后的次數(shù)比較和PPTg-DBS前后的均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、假手術(shù)組大鼠在立體定向術(shù)前和術(shù)后4周相比較,四只腳爪的步幅、擺動速度、支撐相時間、最大接觸面積時間比率、最大接觸面積、平均壓力的這些參數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；反應(yīng)四只腳爪協(xié)調(diào)性的支撐基數(shù)、正常步序模式、行走支撐模式、規(guī)律指數(shù)的這些參數(shù)也沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 2、6-OHDA組與假手術(shù)組相比較,四個腳爪的步幅、擺動速度減小了,支撐相時間和最大接觸面積時間比率增加了,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；但是,最大接觸面積和平均壓力這兩個參數(shù)只有在患側(cè)(左側(cè))前后腳爪減小了,有統(tǒng)計學(xué)差異,而健側(cè)(右側(cè))前后腳爪的這兩個參數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。前腳爪的支撐基數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而后腳爪的支撐基數(shù)變大,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。反應(yīng)四只腳爪的協(xié)調(diào)性的正常步序模式、行走支撐模式、規(guī)律指數(shù)的這些參數(shù)的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3、6-OHDA+電極組與6-OHDA組相比較,四只腳爪的步幅、擺動速度、支撐相時間、最大接觸面積時間比率、最大接觸面積、平均壓力的這些參數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；反應(yīng)四只腳爪協(xié)調(diào)性的支撐基數(shù)、規(guī)律指數(shù)的這兩個參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；但是,正常步序模式、行走支撐模式的差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 4、6-OHDA+電極組大鼠在PPTg-DBS后與PPTg-DBS前相比較,四只腳爪的步幅、擺動速度提高,支撐相時間、最大接觸面積時間比率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；患側(cè)(左側(cè))的前后爪的最大接觸面積和平均壓力增加,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而健側(cè)(右側(cè))的這兩個參數(shù)變化并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。同時,雙后肢的支撐基數(shù)恢復(fù)(P0.01)；但是,正常步序模式的類型占比、行走支撐模式以及規(guī)律指數(shù)在PPTg-DBS后并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論： 1、Catwalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)能同時檢測出偏側(cè)PD模型大鼠步態(tài)的動態(tài)、靜態(tài)和肢體間協(xié)調(diào)的參數(shù)變化。 2、建立了用于PPTg-DBS研究的偏側(cè)6-OHDA毀損PD大鼠模型。 3、PPTg-DBS可以調(diào)控PD模型大鼠的步態(tài)行為,改善其步態(tài)障礙。 4、PPTg的電極植入可能影響了偏側(cè)PD模型大鼠的正常步序模式和行走支撐模式,而且一定刺激參數(shù)下的PPTg-DBS不能恢復(fù)其運動協(xié)調(diào)性。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 腦深部電刺激 腳橋被蓋核 步態(tài) Catwalk
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R742.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-21
• 第二章 材料與方法21-31
• 2.1 實驗材料21-24
• 2.2 實驗方法24-31
• 第三章 結(jié)果31-38
• 3.1 大鼠的剔除情況31
• 3.2 免疫組化染色結(jié)果31-32
• 3.3 尼氏染色結(jié)果32
• 3.4 大鼠Catwalk自動步態(tài)檢測結(jié)果32-38
• 第四章 討論38-42
• 第五章 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-47
• 綜述47-57
• 參考文獻52-57
• 中英文縮略詞對照表57-58
• 攻讀學(xué)位期間成果58-59
• 致謝59-60

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