本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲外分泌蛋白、跨膜蛋白基因篩選與無縫克隆，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討無縫克隆技術(shù)在構(gòu)建日本血吸蟲基因重組質(zhì)粒中的應(yīng)用價(jià)值。方法:從血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫中篩選含有信號(hào)肽或跨膜結(jié)構(gòu)域的基因,截取胞外段大于110個(gè)氨基酸殘基的基因片段。根據(jù)無縫克隆技術(shù)原理,設(shè)計(jì)引物。以日本血吸蟲基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化后的PCR產(chǎn)物與線性化載體p ET32c(+)/Bam HⅠ+XhoⅠ以摩爾比6∶1混和,利用Seamless cloning enzyme在25℃反應(yīng)30 min�；瘜W(xué)法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌Trans 5α,菌落PCR篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒,Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證后送測序。測序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行序列分析。結(jié)果:通過生物信息學(xué)軟件分析,在日本血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫中共篩選到278個(gè)含有信號(hào)肽或跨膜結(jié)構(gòu)域且胞外段大于110個(gè)氨基酸殘基的目標(biāo)基因。對(duì)其中41個(gè)單一外顯子的基因進(jìn)行了無縫克隆引物設(shè)計(jì)和合成。PCR成功擴(kuò)增到33個(gè)基因片段,并與線性化的p ET32c(+)進(jìn)行無縫克隆連接。經(jīng)菌落PCR和酶切驗(yàn)證獲得28個(gè)陽性重組質(zhì)粒。測序顯示28個(gè)插入基因片段序列正確。結(jié)論:利用Seamless克隆技術(shù)成功獲取了一批含有日本血吸蟲基因或基因片段的重組質(zhì)粒,省去了傳統(tǒng)的酶切、連接、去磷酸化等手段,節(jié)省了時(shí)間,提高了效率,為后續(xù)的日本血吸蟲免疫組學(xué)的高通量抗原篩選和鑒定奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;江蘇省血吸蟲病防治研究所;
【關(guān)鍵詞】： 日本血吸蟲 無縫克隆 高通量免疫篩選
【基金】：國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項(xiàng)目(科學(xué)部綜合管理項(xiàng)目,81441119) 湖北省自然基金面上項(xiàng)目(2014CFB648) 湖北省教育廳指導(dǎo)性項(xiàng)目(B2014057) 湖北醫(yī)藥學(xué)院研究生啟動(dòng)金(2013QDJZR04) 基礎(chǔ)研究探索項(xiàng)目(2014XKJSTS01) 校級(jí)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2014XKJSXJ04)
【分類號(hào)】：R392;R383.24
【正文快照】： 血吸蟲病是由血吸蟲引起的嚴(yán)重危害人類身體健康的人獸共患寄生蟲病,也是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。其主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),受威脅人口高達(dá)6億,至少有2.3億人感染該疾病,患者約2000萬[1]。雖然為防控血吸蟲病人類已經(jīng)付出了很多努力,但至今仍然缺乏有效疫苗和可以進(jìn)行療效考

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：456221