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轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在細(xì)胞氧化應(yīng)激中特定功能的研究

發(fā)布時(shí)間:2017-06-16 01:05

  本文關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在細(xì)胞氧化應(yīng)激中特定功能的研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:氧化應(yīng)激是指機(jī)體細(xì)胞在遭受各種有害刺激時(shí),體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮自由基(Reactivenitrogenspecies,RNS)產(chǎn)生過多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,從而對(duì)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物大分子造成損傷。p53是一個(gè)腫瘤抑制基因,它的活性主要依賴于翻譯后修飾,如磷酸化,泛素化和乙酰化等。在正常細(xì)胞中,p53表達(dá)水平很低,但DNA損傷后,p53蛋白水平會(huì)急劇增加,一方面介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,為DNA損傷修復(fù)提供足夠的時(shí)間;另一方面,p53蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身具有核酸內(nèi)切酶的活性,可切除錯(cuò)配核苷酸行使DNA修復(fù)功能。 FOXM1是Forkheadbox轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,與細(xì)胞增殖、衰老、DNA損傷修復(fù)、再生和腫瘤等許多生理病理過程都有密切關(guān)系。本課題通過DNA損傷標(biāo)志物的檢測(cè)及單細(xì)胞凝膠電泳分析,在細(xì)胞中建立了H2O2和紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型。此外,構(gòu)建了干擾FOXM1表達(dá)的慢病毒載體,并分別制得滴度較高的FOXM1干擾慢病毒和FOXM1高表達(dá)慢病毒。在紫外線誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中,我們發(fā)現(xiàn)FOXM1的蛋白表達(dá)水平會(huì)上調(diào),可見FOXM1在氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用,由此,我們?cè)O(shè)想干擾掉FOXM1的表達(dá)是否會(huì)對(duì)DNA氧化損傷修復(fù)產(chǎn)生影響。用單細(xì)胞凝膠電泳分析,發(fā)現(xiàn)紫外線處理24h后,干擾了FOXM1表達(dá)的細(xì)胞中DNA損傷程度很高,,這說明FOXM1能夠幫助人骨肉瘤細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激DNA損傷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)一些DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)氧化損傷重要修復(fù)通路堿基切除修復(fù)的相關(guān)基因PARP1,在干擾FOXM1表達(dá)后明顯下調(diào)。其次,ATR的mRNA水平也明顯下調(diào),這些結(jié)果預(yù)示FOXM1可能通過調(diào)控PARP1和ATR等DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)參與氧化應(yīng)激過程。綜上所述,轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在DNA氧化損傷應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】:氧化應(yīng)激 p53 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1 DNA損傷修復(fù)
【學(xué)位授予單位】:湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號(hào)】:R363
【目錄】:
  • 摘要5-6
  • Abstract6-9
  • 英文縮寫9-10
  • 第1章 緒論10-20
  • 1.1 細(xì)胞壓力損傷10-14
  • 1.1.1 氧化應(yīng)激10-11
  • 1.1.2 DNA損傷修復(fù)11-13
  • 1.1.3 相關(guān)基因簡(jiǎn)介13-14
  • 1.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1概述14-18
  • 1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的結(jié)構(gòu)14-15
  • 1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的功能15-18
  • 1.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞18-19
  • 1.4 研究目的與方法19-20
  • 第2章 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建20-32
  • 2.1 前言20-21
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)材料21-22
  • 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-29
  • 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
  • 2.3.2 免疫印跡(immunoblotting)22-25
  • 2.3.3 單細(xì)胞凝膠電泳25-26
  • 2.3.4 半定量RT-PCR26-29
  • 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
  • 2.4.1 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型建立29
  • 2.4.2 UV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型建立29-31
  • 2.5 討論31-32
  • 第3章 FOXM1干擾及高表達(dá)體系的構(gòu)建32-43
  • 3.1 前言32
  • 3.2 實(shí)驗(yàn)材料32-34
  • 3.3 實(shí)驗(yàn)方法34-39
  • 3.3.1 靶向人源FOXM1基因shRNA的設(shè)計(jì)及合成34
  • 3.3.2 干擾載體的酶切與回收34-35
  • 3.3.3 片段的連接與轉(zhuǎn)化35-36
  • 3.3.4. 重組質(zhì)粒的鑒定36-37
  • 3.3.5 質(zhì)粒大提37-38
  • 3.3.6 人源FOXM1干擾及高表達(dá)慢病毒制備38-39
  • 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-41
  • 3.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建39
  • 3.4.2 U2OS細(xì)胞FOXM1干擾體系的建立39-40
  • 3.4.4 MEF細(xì)胞FOXM1高表達(dá)體系建立40-41
  • 3.5 討論41-43
  • 第4章 FOXM1有助于U2OS細(xì)胞抵抗UV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激43-49
  • 4.1 前言43
  • 4.2 實(shí)驗(yàn)材料43-45
  • 4.3 實(shí)驗(yàn)方法45
  • 4.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR45
  • 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-47
  • 4.4.1 FOXM1與氧化應(yīng)激過程關(guān)聯(lián)性的研究45-46
  • 4.4.2 在U2OS中干擾FOXM1后對(duì)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程的影響46-47
  • 4.4.3 在U2OS細(xì)胞中干擾FOXM1表達(dá)對(duì)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的影響47
  • 4.5 討論47-49
  • 總結(jié)與展望49-51
  • 參考文獻(xiàn)51-58
  • 附錄A 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄58-59
  • 附錄B FOXM1對(duì)氧化應(yīng)激過程中P53表達(dá)水平的影響59-63
  • 附錄C 常用緩沖液和試劑配方63-64
  • 致謝64

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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10 郝向偉;家蠶Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)基因的克隆、鑒定及其功能分析[D];西南大學(xué);2013年


  本文關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在細(xì)胞氧化應(yīng)激中特定功能的研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



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