本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在細(xì)胞氧化應(yīng)激中特定功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：氧化應(yīng)激是指機體細(xì)胞在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies,ROS）和活性氮自由基（Reactivenitrogenspecies,RNS）產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而對DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物大分子造成損傷。p53是一個腫瘤抑制基因，它的活性主要依賴于翻譯后修飾，如磷酸化，泛素化和乙�；取Ｔ谡＜�(xì)胞中，p53表達水平很低，但DNA損傷后，p53蛋白水平會急劇增加，一方面介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，為DNA損傷修復(fù)提供足夠的時間；另一方面，p53蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身具有核酸內(nèi)切酶的活性，可切除錯配核苷酸行使DNA修復(fù)功能。 FOXM1是Forkheadbox轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，與細(xì)胞增殖、衰老、DNA損傷修復(fù)、再生和腫瘤等許多生理病理過程都有密切關(guān)系。本課題通過DNA損傷標(biāo)志物的檢測及單細(xì)胞凝膠電泳分析，在細(xì)胞中建立了H2O2和紫外線誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型。此外，構(gòu)建了干擾FOXM1表達的慢病毒載體，并分別制得滴度較高的FOXM1干擾慢病毒和FOXM1高表達慢病毒。在紫外線誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中，我們發(fā)現(xiàn)FOXM1的蛋白表達水平會上調(diào)，可見FOXM1在氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用，由此，我們設(shè)想干擾掉FOXM1的表達是否會對DNA氧化損傷修復(fù)產(chǎn)生影響。用單細(xì)胞凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)紫外線處理24h后，干擾了FOXM1表達的細(xì)胞中DNA損傷程度很高，，這說明FOXM1能夠幫助人骨肉瘤細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激DNA損傷。實時熒光定量PCR檢測一些DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)氧化損傷重要修復(fù)通路堿基切除修復(fù)的相關(guān)基因PARP1，在干擾FOXM1表達后明顯下調(diào)。其次，ATR的mRNA水平也明顯下調(diào)，這些結(jié)果預(yù)示FOXM1可能通過調(diào)控PARP1和ATR等DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達參與氧化應(yīng)激過程。綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在DNA氧化損傷應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：氧化應(yīng)激 p53 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1 DNA損傷修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 英文縮寫9-10
• 第1章 緒論10-20
• 1.1 細(xì)胞壓力損傷10-14
• 1.1.1 氧化應(yīng)激10-11
• 1.1.2 DNA損傷修復(fù)11-13
• 1.1.3 相關(guān)基因簡介13-14
• 1.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1概述14-18
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的功能15-18
• 1.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞18-19
• 1.4 研究目的與方法19-20
• 第2章 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建20-32
• 2.1 前言20-21
• 2.2 實驗材料21-22
• 2.3 實驗方法22-29
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.3.2 免疫印跡（immunoblotting）22-25
• 2.3.3 單細(xì)胞凝膠電泳25-26
• 2.3.4 半定量RT-PCR26-29
• 2.4 實驗結(jié)果29-31
• 2.4.1 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型建立29
• 2.4.2 UV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型建立29-31
• 2.5 討論31-32
• 第3章 FOXM1干擾及高表達體系的構(gòu)建32-43
• 3.1 前言32
• 3.2 實驗材料32-34
• 3.3 實驗方法34-39
• 3.3.1 靶向人源FOXM1基因shRNA的設(shè)計及合成34
• 3.3.2 干擾載體的酶切與回收34-35
• 3.3.3 片段的連接與轉(zhuǎn)化35-36
• 3.3.4. 重組質(zhì)粒的鑒定36-37
• 3.3.5 質(zhì)粒大提37-38
• 3.3.6 人源FOXM1干擾及高表達慢病毒制備38-39
• 3.4 實驗結(jié)果39-41
• 3.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建39
• 3.4.2 U2OS細(xì)胞FOXM1干擾體系的建立39-40
• 3.4.4 MEF細(xì)胞FOXM1高表達體系建立40-41
• 3.5 討論41-43
• 第4章 FOXM1有助于U2OS細(xì)胞抵抗UV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激43-49
• 4.1 前言43
• 4.2 實驗材料43-45
• 4.3 實驗方法45
• 4.3.1 實時熒光定量PCR45
• 4.4 實驗結(jié)果45-47
• 4.4.1 FOXM1與氧化應(yīng)激過程關(guān)聯(lián)性的研究45-46
• 4.4.2 在U2OS中干擾FOXM1后對DNA損傷修復(fù)進程的影響46-47
• 4.4.3 在U2OS細(xì)胞中干擾FOXM1表達對DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的影響47
• 4.5 討論47-49
• 總結(jié)與展望49-51
• 參考文獻51-58
• 附錄A 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄58-59
• 附錄B FOXM1對氧化應(yīng)激過程中P53表達水平的影響59-63
• 附錄C 常用緩沖液和試劑配方63-64
• 致謝64

【共引文獻】

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本文編號：453958